BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ********** KHỔNG TRỌNG QUÂN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU THỰC NGHIỆM CỦA STEPHANIA SINICA DIELS. VÀ STEPHANIA DIELSIANA Y.C. WU, HỌ TIẾT DÊ MENISPERMACEAE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI KHỔNG TRỌNG QUÂN NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG GIẢI LO ÂU THỰC NGHIỆM CỦA STEPHANIA SINICA DIELS. VÀ STEPHANIA DIELSIANA Y.C. WU, HỌ TIẾT DÊ MENISPERMACEAE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Nơi thực hiện: HÀ NỘI – 2013 1.TS. Đào Thị Vui 2.TS. Nguyễ n Hoàng Anh Bộ môn Dược lự c LỜI CẢM ƠN Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Hoàng Anh, TS. Đào Thị Vui, Ths. Nguyễn Thu Hằng, Bộ môn Dược lực, TS. Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dược liệu, TS. Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, trường ĐH Dược Hà Nội. Là những người thầy, người cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Đinh Đại Độ, kỹ thuật viên tại bộ môn Dược lực trường ĐH Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và trực tiếp thực hiện nhiều công việc xuyên suốt trong quá trình tiến hành đề tài. Nhân đây em cũng xin gửi lời cảm ơn tới: Các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược lực đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ để em có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất. Các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường. Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Khổng Trọng Quân MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1. Chi Stephania Lour.: Thành phần hóa học và các tác dụng dược lý tâm thần/thần kinh 3 1.1.1.Thành phần hóa học 3 1.1.2.Hàm lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin trong các loài bình vôi ở Việt Nam 3 1.1.2.1.Alcaloid toàn phần 3 1.1.2.2.Hàm lượng L-tetrahydropalmatin (Rotundin) 4 1.1.3.Tác dụng dược lý hướng thần kinh của các loài thuộc chi Stephania Lour. 6 1.2. Về hai loài Stephania dielsiana Y.C.Wu và Stephania sinica Diels 9 1.2.1.Đặc điểm thực vật 9 1.2.2.Thành phần hóa học 10 1.2.3.Các nghiên cứu về tác dụng dược lý hướng thần kinh và tâm thần 14 CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1.Nguyên liệu 15 2.1.1.Dược liệu 15 2.1.2.Hóa chất và thiết bị 15 2.1.3.Động vật thực nghiệm 16 2.1.4.Chuẩn bị thuốc thử 16 2.2.Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1.Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 17 2.2.2.Nội dung nghiên cứu 17 2.2.3.Điều kiện tiến hành thí nghiệm 18 2.2.4.Liều sử dụng trong nghiên cứu 18 2.2.5.Mô hình gây stress cho chuột bằng phương pháp nuôi cô lập 19 2.2.6.Đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình EPM 19 2.2.7.Đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình ETM 21 2.2.8.Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental. 22 2.3.Xử lý số liệu 23 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1.Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần S. dielsiana và S. sinica 24 3.1.1.Trên mô hình EPM ở chuột không chịu stress 24 3.1.2.Trên mô hình EPM ở chuột chịu stress do cô lập 26 3.1.3.Trên mô hình ETM 28 3.2. Đánh giá tác dụng an thần của dịch chiết nước toàn phần của S. dielsiana và S. sinica 29 3.2.1.Trên chuột không chịu stress 29 3.2.2.Trên chuột chịu stress do cô lập 30 3.3. Đánh giá tác dụng giải lo âu và an thần của alcaloid toàn phần từ S. dielsiana và S. sinica 31 3.3.1. Chiết xuất alcaloid từ củ 2 loài Stephania 31 3.3.2.Đánh giá tác dụng giải lo âu của alcaloid toàn phần từ S. dielsiana và S. sinica 32 3.3.3.Đánh giá tác dụng an thần của alcaloid toàn phần từ 2 loài Stephania 35 3.4.Bàn luận 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Akt Protein kinase B BDNF Yếu tố kích thích thần kinh đến từ não (Brain-derived neurotrophic factor) CREB Protein liên kết từng phần đáp ứng với AMP vòng (Cyclic-AMP response element-binding protein) CRF Yếu tố giải phóng corticotropin (Corticotropin-releasing factor) DZP Diazepam EPM Chữ thập nâng cao (Elevated plus maze) ERK Protein chuyển gốc phosphat điều hòa tín hiệu ngoại bào (Extracellular signal-regulated kinase) ETM Chữ T nâng cao (Elevated T maze) GABA Gamma amino butyric acid GAD Rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized anxiety disorder) IL- 1β Interleukin 1 beta NF- ҡB Yếu tố nhân làm giàu chuỗi nhẹ kappa của tê bào B đã hoạt hóa (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) NMDA N-methyl-D-aspartat PD Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder) SPD Stepholidin THP Tetrahydropalmatin Rf Hệ số lưu MeOH Methanol DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Nguyễn Tiến Vững) 3 1.2 Kết quả định lượng alcaloid toàn phần (Lã Đình Mỡi) 4 1.3 Kết quả định lượng THP (Nguyễn Tiến Vững) 4 1.4 Kết quả định lượng THP (Lã Đình Mỡi) 5 1.5 Kết quả định lượng THP (Nguyễn Quốc Huy) 5 3.1 Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên thời gian lưu và số lần ra tay mở của chuột không chịu stress trên mô hình EPM 24 3.2 Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên số lần vào tay kín và tổng số lần lưu tại tay kín, tay mở của chuột không chịu stress trên mô hình EPM 25 3.3 Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên số lần và thời gian lưu tại tay mở của chuột chịu stress trên mô hình EPM 27 3.4 Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và diazepam trên số lần vào tay kín và tổng số lần lưu tại tay kín, tay mở của chuột chịu stress trên mô hình EPM 27 3.5 Tác dụng của dịch chiết nước toàn phần và clomipramin trên chuột không chịu stress thể hiện qua các chỉ tiêu đánh giá trên mô hình ETM 29 3.6 Tác dụng của alcaloid toàn phần, diazepam và tetrahydropalmatin trên số lần và thời gian lưu tại tay mở của chuột không chịu stress trên mô hình EPM 33 3.7 Tác dụng của alcaloid toàn phần, diazepam và tetrahydropalmatin trên số lần vào tay kín và thời gian lưu tại tay kín, tay mở của chuột không chịu stress trên mô hình EPM 34 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Sắc ký đồ của dịch chiết alcaloid toàn phần của 6 loài thuộc chi Stephania Lour. (UV 254 và 365 nm) 6 2.1 Hình ảnh củ loài Stephania sinica Diels. 15 2.2 Hình ảnh củ loài Stephania dielsiana Y.C.Wu. 15 2.3 Hình ảnh chuột nuôi cô lập để gây stress 19 2.4 Mô hình chữ thập nâng cao 20 2.5 Mô hình chữ T nâng cao 21 2.6 Dụng cụ chữ T nâng cao 21 3.1 Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam (DZP) và dịch chiết nước toàn phần (DC) của 2 loài Stephania trên chuột bình thường 30 3.2 Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam (DZP) và dịch chiết nước toàn phần (DC) của 2 loài Stephania trên chuột chịu stress do cô lập 31 3.3 Sắc ký lớp mỏng đã phun thuốc thử hiện màu có đối chiếu với chất chuẩn tetrahydropalmatin 32 3.4 Ảnh hưởng trên thời gian ngủ do thiopental của diazepam (DZP), tetrahydropalmatin (THP) và alcaloid toàn phần của 2 loài Stephania trên chuột bình thường 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lo âu (anxiety disorders) là sự lo sợ quá mức trước một tình huống xảy ra, có tính chất vô lý, lặp lại và kéo dài gây ảnh hưởng đến sự thích nghi với cuộc sống của người bệnh. Đây là một trong những rối loạn tâm lý có tính phổ biến cao, có xu hướng ngày càng gia tăng, thường kết hợp với nhiều rối loạn khác như mất ngủ, trầm cảm, rối loạn ăn uống, rối loạn hành vi [14]. Hiện nay, phương pháp điều trị rối loạn lo âu chủ yếu là phối hợp liệu pháp tâm lý với thuốc giải lo âu (anxiolytics). Các thuốc giải lo âu có nguồn gốc hóa dược chính được sử dụng là các dẫn chất của benzodiazepin, buspiron và các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin hoặc chống trầm cảm 3 vòng [17]. Hạn chế lớn nhất của các thuốc có nguồn gốc hóa dược là tác dụng phụ, khả năng lệ thuộc thuốc và phản ứng cai thuốc xảy ra khi dừng điều trị. Thêm vào đó, giá thành cao của các thuốc này cũng là vấn đề cần quan tâm khi sử dụng thuốc hàng ngày trong một thời gian dài cho bệnh nhân. Vì vậy, sử dụng các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dược liệu hiện được coi là hướng tiếp cận bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hóa dược trong điều trị rối loạn lo âu [47]. Chi Stephania Lour. là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) với khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á, châu Phi và châu Úc. Trong lĩnh vực dược lý thần kinh và tâm thần, nghiên cứu về các loài trong chi chủ yếu tập trung trên tác dụng chống loạn tâm thần, hướng điều trị Alzheimer, an thần và giải lo âu. Nhiều nghiên cứu hóa học và dược lý đã được thực hiện để làm sáng tỏ các hướng tác dụng trên trong đó nhiều alkaloid có hoạt tính sinh học đã được phân lập và xác định cấu trúc [48]. Tại Việt nam, các loài của chi Stephania Lour. được nghiên cứu khá đầy đủ về hóa học và tác dụng sinh học hướng an thần trên cơ sở chiết tách L- tetrahydropalmatin và kinh nghiệm sử dụng của nhân dân [6], [16]. Hướng nghiên cứu của đề tài tập trung vào đánh giá tác dụng dược lý thần kinh và tâm thần của hai loài Stephania được phát hiện ở Ba vì (Hà nội) và Phong Nha (Quảng Bình) là Stephania sinica Diels. (bình vôi tán ngắn) và Stephania dielsiana Y.C. Wu. (củ 2 dòm) [6]. Quan sát của Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Quốc Huy cho thấy dịch chiết S. dielsiana có tác dụng giảm hoạt động của chuột và kéo dài thời gian ngủ do thiopental gấp 3 lần và 8 lần so với nhóm chứng khi dùng liều tương ứng 1,25g/kg và 2,5g/kg [10]. Nghiên cứu ban đầu về hóa học của Đỗ Quyên, Nguyễn Quốc Huy và cộng sự cũng cho thấy có sự khác biệt về thành phần alcaloid giữa các loài Stephania, trong khi tỷ lệ L-tetrahydropalmatin ở S. sinica là khoảng 2,43% thì ở S. dielsiana chỉ là 0,4% [6]. Những kết quả này gợi ý cho hướng nghiên cứu sâu hơn về tác dụng an thần và giải lo âu của S. sinica và S. dielsiana đồng thời tìm hiểu xem liệu tác dụng này có phụ thuộc vào sự có mặt của L-tetrahydropalmatin trong dược liệu hay không. Xuất phát từ thực tế đó, đề tài được triển khai với mục tiêu đánh giá tác dụng giải lo âu và an thần thực nghiệm của dịch chiết nước và alcaloid toàn phần của Stephania sinica Diels. và Stephania dielsiana Y.C. Wu. trên chuột bình thường và chuột chịu stress do cô lập. [...]... HO NH H3CO N-CH 3 OH O OCH 3 15 5 O N O H 3C O N O H 3C H H3CO H 3CO 16 17 14 1.2.3 C c nghiên c u về t c dụng dư c lý hướng thần kinh và tâm thần Tìm kiếm trên c sở dữ liệu Pubmed/Medline với c c từ khóa Stephania sinica Diels và Stephania dielsiana Y. C Wu chưa tìm th y bất c c ng bố nào về t c dụng sinh h c liên quan đến t c dụng an thần và giải lo âu c a hai lo i c ng bố bởi c c t c giả nư c ngoài... ngoài Trong nư c, Nguyễn Qu c Huy và c ng sự đã x c định đư c liều LD50 c a c lo i S dielsiana là 22,2 g/kg và thử t c dụng chống viêm và giảm đau th c nghiệm c a lo i n y [8] Theo đó, c 2 m c liều 2,5 g/kg và 5 g/kg đều không c t c dụng giảm đau theo c chế trung ương theo phương pháp g y đau bằng mâm nóng Theo hướng tiếp c n sàng l c dư c liệu c t c dụng c chế acetylcholinesterase c tiềm năng... Phương pháp nghiên c u 2.2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên c u C c a 2 lo i Stephania sinica và Stephania dielsiana Dịch chiết nư c toàn phần Giải lo âu, chuột không chịu stress, EPM Giải lo âu, chuột không chịu stress, ETM Giải lo âu, chuột chịu stress, EPM An thần, chuột không chịu stress An thần, chuột chịu stress Alcaloid toàn phần Giải lo âu, chuột không chịu stress, EPM An thần, chuột không chịu stress... tất c c c m c liều c n lại đều thể hiện t c rõ rệt trên c số lần di chuyển vào tay mở và thời gian lưu lại tay n y Ở c ng một m c liều, t c dụng c a 2 lo i Stephania kh c nhau không c ý nghĩa thống kê và tương đương với t c dụng c a diazepam (2 mg/kg) Chỉ số số lần vào tay kín c a c c lô không c sự kh c biệt c ý nghĩa so với lô chứng NaCl, diazepam và S dielsiana m c liều 100 mg/kg làm tăng c ý... Nội dung nghiên c u Thiết kế 4 đợt thí nghiệm với c c nội dung sau: đánh giá t c dụng giải lo âu (mô hình chữ thập nâng cao, elevated plus maze, EPM) và an thần (tăng c ờng thời gian ngủ do thiopental) trên chuột bình thường c a dịch chiết toàn phần với dung môi là nư c c a 2 lo i Stephania ở c c m c liều kh c nhau c đối chiếu với t c dụng c a diazepam (đợt 1) T c dụng giải lo âu c a dịch chiết toàn... 1.1.3 T c dụng dư c lý hướng thần kinh c a c c lo i thu c chi Stephania Lour Trong lĩnh v c dư c lý thần kinh và tâm thần, nghiên c u về c c lo i trong chi Stephania chủ y u tập trung trên t c dụng chống rối lo n tâm thần, t c dụng hướng điều trị Alzheimer và t c dụng an thần và giải lo âu (-)- Stepholidine (SPD) phân lập từ S intermedia H.S Lo đã đư c chứng minh c hoạt tính đối kháng receptor D2 c a dopamin... [23] T c dụng c chế thần kinh trung ương c a dl-tetrahydropalmatin (THP), một alkaloid đư c phân lập từ nhiều lo i trong chi Stephania đã đư c chứng minh trên c c mô hình dư c lý th c nghiệm Ở liều thấp (0,5 – 10 mg/kg), THP c t c dụng giải lo âu rõ rệt, t c dụng an thần và giãn c chỉ thể hiện ở liều cao (50 mg/kg) T c dụng giải lo âu c a tetrahydropalmatin bị đối kháng bởi flumazenil, một chất c nh...3 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Chi Stephania Lour.: Thành phần hóa h c và c c t c dụng dư c lý tâm thần/thần kinh 1.1.1 Thành phần hóa h c Thành phần hóa h c c a chi Stephania Lour gồm c alcaloid, flavonoid, tinh bột, đường khử, acid malic, enzym oxydase Trong đó alcaloid là thành phần chính và đư c quan tâm nhiều nhất [48] C c alcaloid đã phân lập từ c c lo i trong chi Stephania Lour c thể xếp vào 9... t c dụng giải lo âu trên mô hình ETM Mô hình chữ T nâng cao theo mô tả c a Graeff và c ng sự [24] Hình 2.5 Mô hình chữ T nâng cao Dụng c thí nghiệm Hình 2.6 Dụng c chữ T nâng cao 22 Dụng c thí nghiệm bằng gỗ đư c cấu tạo là hình chữ T gồm 1 c nh tay kín kích thư c 50 x 12 x 40cm (dài x rộng x cao) và 2 tay mở kích thư c 50 x 12 x 1 cm, tay kín đư c đặt vuông g c với 2 tay mở Bộ dụng c đư c đặt c ch... động c a chuột Dịch chiết dư c liệu c t c dụng kéo dài thời gian ngủ do thiopental gấp 3 lần và 8 lần so với nhóm chứng khi dùng liều tương ứng 1,25 g/kg và 2,5 g/kg [10] 15 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Dư c liệu C c a lo i bình vôi Stephania dielsiana Y. C. Wu., họ Tiết dê (Menispermaceae) thu hái tại Ba Vì, Hà Nội và c c a lo i bình vôi Stephania sinica Diels. , . Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H C DƯ C HÀ NỘI ********** KHỔNG TRỌNG QUÂN NGHIÊN C U T C DỤNG GIẢI LO ÂU TH C NGHIỆM C A STEPHANIA SINICA DIELS. VÀ STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU, HỌ TIẾT DÊ. y u là phối hợp liệu pháp tâm lý với thu c giải lo âu (anxiolytics). C c thu c giải lo âu c nguồn g c hóa dư c chính đư c sử dụng là c c dẫn chất c a benzodiazepin, buspiron và c c thu c chống. T c dụng dư c lý hướng thần kinh c a c c lo i thu c chi Stephania Lour. Trong lĩnh v c dư c lý thần kinh và tâm thần, nghiên c u về c c lo i trong chi Stephania chủ y u tập trung trên t c dụng