Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

59 1.3K 0
Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ PHẤN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ PHẤN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS.Nguyễn Tiến Vững 2. TS.Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa Dược- Trường ĐH Dược Hà Nội 2. Khoa Y Dược, ĐHQGHN HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Tiến Vững - Viện Pháp y Quốc gia, TS. Nguyễn Thị Thuận - giảng viên bộ môn Hóa dược- Trường ĐH Dược Hà Nội và ThS. Vũ Đức Lợi- khoa Y Dược, ĐHQGHN, đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các kỹ thuật viên bộ môn hóa dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và khoa Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại trường. Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Cám ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lương Thị Phấn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… 1 Chương 1. TỔNG QUAN………………………………………… 3 1.1. Hợp chất strychnin……………………………………………………… 3 1.1.1. Công thức cấu tạo………………………………………… 3 1.1.2. Tính chất……………………………………………………………… 3 1.1.3. Dược động học…………………………………………………………. 3 1.1.4. Tác dụng……………………………………………………………… 4 1.2. Hợp chất brucin…………………………………………………………… 4 1.2.1. Công thức cấu tạo………………………………………… 4 1.2.2. Tính chất……………………………………………………………… 4 1.2.3. Dược động học…………………………………………………………. 4 1.2.4. Tác dụng……………………………………………………………… 5 1.3. Nguồn gốc của strychnin và brucin……………………………………… 5 1.3.1. Tên khoa học……………………………………………… 5 1.3.2. Thành phần hóa học……………………………………… 5 1.3.3. Công dụng của mã tiền…………………………………… 5 1.4. Phương pháp định lượng strychnin và brucin…………… 6 1.5. Phương pháp HPLC………………………………………………………. 9 1.5.1. Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao………………………………. 9 1.5.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký………………………………………. 10 1.5.3. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký…………………………. 10 1.5.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký…………………… 10 1.5.5. Ứng dụng của phương pháp HPLC……………………… 11 1.6. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương………………………………. 12 1.6.1. Tủa protein…………………………………………………………… 12 1.6.2. Chiết lỏng- lỏng…………………………………………… 12 1.6.3. Chiết pha rắn……………………………………………… 13 1.7. Thẩm định phương pháp định lượng……………………………………. 13 1.7.1. Tính thích hợp hệ thống……………………………………………… 13 1.7.2. Độ chọn lọc…………………………………………………………… 13 1.7.3. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính………………………………… 13 1.7.4. Giới hạn định lượng dưới…………………………………………… 14 1.7.5. Độ đúng…………………………………………………… 14 1.7.6. Độ chính xác…………………………………………………………… 14 1.7.7. Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 14 1.7.8. Độ ổn định………………………………………………… 14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị……………………………………………… 15 2.1.1. Nguyên vật liệu………………………………………………………… 15 2.1.2. Trang thiết bị , dụng cụ…………………………………… 15 2.2. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………. 15 2.2.1. Chuẩn bị các mẫu huyết tương……………………………………… 15 2.2.2. Xác định điều kiện sắc ký………………………………… 17 2.2.3. Xây dựng quy trình xử lý mẫu huyết tương……………… 18 2.2.4. Thẩm định phương pháp phân tích…………………………………… 19 2.2.5. Phương pháp xử lý kết quả……………………………………………. 22 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 23 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC………………………………… 23 3.1.1. Khảo sát điều kiện HPLC và chuẩn nội của phương pháp 23 3.1.2. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương……… 26 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích……………………………………… 28 3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống…………………………………………… 28 3.2.2. Độ đặc hiệu- chọn lọc………………………………………………… 29 3.2.3. Đường chuẩn- khoảng tuyến tính…………………………………… 31 3.2.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……………………………………. 33 3.2.5. Độ đúng- độ chính xác trong ngày và khác ngày…………………… 34 3.2.6. Hiệu suất chiết…………………………………………………………. 37 3.2.7. Độ ổn định của mẫu huyết tương………………………… 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………… 42 1. Kết luận……………………………………………………………………… 42 2. Kiến nghị………………………………………………………………… 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………… 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHƯ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril BR : Brucin ESI : Ion hóa electrospray (Electrospray ionization). GC/MS : Sắc ký khí/ detector khối phổ (Gas Chromatography/Mass Spectrometry). HPLC : Sắc ký lỏng hiệ u năng cao (High Performance Liquid Chromatography). HPLC/DAD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector diod array (High Performance Liquid Chromatography/Diode Array Detection). HPLC/MS : Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector khối phổ (High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry). HPLC/UV : Sắc ký lỏng hiệu năng cao/detector UV ((High Performance Liquid Chromatography/Ultraviolet). HQC : Mẫu kiểm chứng nồng độ cao (High quality control). HT : Huyết tương IS : Chất chuẩn nội (Internal standard). LC/MS : Sắc ký lỏng/ detector khối phổ (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry). LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower Limit of Quantification). LQC : Mẫu kiểm chứng nồng độ thấp (Low Quality Control). MeOH : Methanol MQC : Mẫu kiểm chứng nồng độ trung bình (Middle Quality Control). QC : Mẫu kiểm chứng (Quality Control). r : Hệ số tương quan. RP-HPLC : Ngược pha sắc ký lỏng hiệu năng cao (Reversed Phase- High Performance Liquid Chromatography). RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard deviation). SKĐ : Sắc ký đồ ST : Strychnin ULOQ : Giới hạn định lượng trên (Upper Limit of Quantification). UPLC : Sắc ký lỏng siêu hiệu năng (Ultra Performance Liquid Chromatography). DANH MỤC CÁC BẢNG Tên Bảng Trang Bảng 1.1. Danh mục các phương pháp định lượng strychnin và brucin 6 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 28 Bảng 3.2a: Sự tương quan giữa nồng độ strychnin trong HT và tỷ lệ đáp ứng pic strychnin/IS 31 Bảng 3.2b. Sự tương quan giữa nồng độ brucin trong HT và tỷ lệ đáp ứng pic brucin/IS 32 Bảng 3.3a. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của strychnin (LLOQ) 33 Bảng 3.3b. Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới của brucin (LLOQ) 33 Bảng 3.4a: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của Strychnin 34 Bảng 3.4b. Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác trong ngày của brucin 35 Bảng 3.5a: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày của strychnin 36 Bảng 3.5b: Kết quả khảo sát độ đúng, độ chính xác khác ngày của brucin 36 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết IS (900ng/ml) 37 Bảng 3.7a: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết ST 38 Bảng 3.7b: Kết quả khảo sát hiệu suất chiết BR 39 Bảng 3.8: Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ đông-rã 39 Bảng 3.9: Kết quả nghiên cứu độ ổn định mẫu HT thời gian ngắn 40 Bảng 3.10: Kết quả ổn định mẫu huyết tương thời gian dài 41 [...]... nhiều phương pháp được đề xuất để xác định strychnin và brucin trong dịch sinh học như: HPLC/ DAD[14], HPLC/ MS[32], LS-ESI-MS[42], HPLC- UV[15], UPLC-MS/MS[41]… Tuy nhiên những phương pháp này chưa phù hợp với tình hình thực tế tại Việt Nam Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC ’... format trong nước với acid formic 0,1% -Tốc độ dòng: 0,25 ml/phút -Nhiệt độ: 40°C m , 2,4 µm) Nhận xét: Phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng GC/MS, UPLC-MS, HPLC- ESI, LC-ESI-MS, khá phức tạp, tốn kém và chưa phù hợp với đa số phòng thí nghiệm ở Việt Nam Vì vây, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC/ UV... quy, hệ số tương quan hồi quy xác định bằng phần mềm Microsolf Excel 2013 - Nồng độ ST và BR trong huyết tương được xác định dựa vảo phương trình hồi quy biểu diễn mối tương quan giữa điện tích pic và nồng độ ST và BR trong mẫu chuẩn được xây dựng trong mỗi ngày phân tích 23 CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC 3.1.1... huyết tương bằng phương pháp HPLC ’ với các mục tiêu sau: 1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương chuột bằng HPLC 2 Thẩm định phương pháp định lượng strychnin và brucin vừa xây dựng 3 CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN 1.1 Hợp chất strychnin 1.1.1 Công thức cấu tạo Công thức phân tử: C21H22N2O2 Phân tử lượng: 334,41 Tên khoa học: (4aR,5aS,8aR,13aS,15aS,15bR)-4a,5,5a,7,8,13a,15,15a,15b,16decahydro-2H-4,6-methanoindolo[3,2,1-ij]oxepino[2,3,4-de]pyrrolo[2,3-h]quinoline14-one... quá 15% và giá trị RSD giữa các kết quả định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15% - Độ ổn định của huyết tương trong thời gian dài: Khoảng thời gian thử nghiệm độ ổn định dài ngày tối thiểu phải đủ để tiến hành lấy mẫu huyết tương và phân tích hết số mẫu huyết tương Bảo quản mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC ở nhiệt độ 20°C, phân tích mẫu tại thời điểm ban đầu và sau từng khoảng thời gian... ST và BR chuẩn trong huyết tương có nồng độ ST và BR lần lượt là 3600ng/ml và 3600ng/ml, để bảo quản trong tủ lạnh sâu (-20°C) Để rã đông ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng - Mẫu huyết tương tự tạo chứa ST và BR: Từ dung dịch huyết tương chuẩn ST và BR trên, thêm huyết tương trắng, lắc đều được các mẫu ST và BR trong huyết tương có nồng độ khoảng từ 40- 1800ng/ml (tương ứng với khoảng nồng độ ST và. .. pha tĩnh Pha tĩnh trong chiết pha rắn thường gồm silica gắn với một nhóm chức đặc biệt [3] Để xử lý mẫu huyết tương, thường sử dụng 1 trong 3 phương pháp chiết như trên.Tuy nhiên phương pháp chiết pha rắn thường phức tạp, tốn thời gian và không kinh tế nên chúng tôi khảo sát với 2 phương pháp là kết tủa protein và chiết lỏng-lỏng để xử lý mẫu huyết tương 1.7 Thẩm định phương pháp định lượng 1.7.1 Tính... hành định lượng các mẫu chuẩn pha trong pha động không qua giai đoạn chiết tách, có nồng độ tương ứng với các mẫu QC So sánh kết quả đáp ứng của ST và BR trong mẫu QC pha trong huyết tương (có qua chiết tách) với đáp ứng của ST và BR trong mẫu tương ứng pha trong dung môi (không qua chiết tách) 2.2.4.8 Độ ổn định của mẫu thử trong huyết tương - Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông-rã: Khảo sát độ ổn định sau... bao gồm: - Độ ổn định 3 chu kỳ đông-rã đông - Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng - Độ ổn định sau khi xử lý mẫu, chiết tách hoạt chất - Độ ổn định dài ngày.[8] 15 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu 2.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Chất chuẩn strychnin hàm lượng 99,2% - Chuất chuẩn brucin hàm lượng 98,9% - Huyết tương chuột nhắt trắng,... dùng trong các trường hợp gân và cơ tê đau, cơ thể suy nhược, đau nhức thần kinh ngoại biên Khứ phong chỉ kinh, dùng trong các bệnh kinh giản, co quắp, chân tay bị quyết lạnh Tán ứ, tiêu thũng, dùng trong các bệnh ung độc hoặc chấn thương cơ nhục sưng tấy [11] 6 1.4 Phương pháp định lượng strychnin và brucin Hiện nay trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu định lượng strychnin và brucin trong . Nghiên cứu định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC ’ với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời strychnin và brucin trong huyết. TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯƠNG THỊ PHẤN NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI STRYCHNIN VÀ BRUCIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn:. LUẬN……… 23 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng strychnin và brucin trong huyết tương bằng HPLC ……………………………… 23 3.1.1. Khảo sát điều kiện HPLC và chuẩn nội của phương pháp 23 3.1.2. Kết quả

Ngày đăng: 28/07/2015, 21:11

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • 1.5.3. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký

  • 1.5.4. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký

  • 1.5.5. Ứng dụng phương pháp HPLC

  • 1.6. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương

  • 1.6.1. Tủa protein

  • 1.6.2. Chiết lỏng-lỏng (liquid-liquid extraction)

  • 1.7.2. Độ chọn lọc

  • 1.7.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan