BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  HOÀNG THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TETRODOTOXIN TRONG PHỦ TẠNG CÁ NÓC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TETRODOTOXIN TRONG PHỦ TẠNG CÁ NÓC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: 1. ThS. Phùng Minh Dũng 2. CN. Vũ Tùng Lâm Nơi thc hin: 1. Bộ môn Hóa Phân Tích 2. Vin kiểm nghim thuốc Trung Ương 3. Công ty CP Dược Phẩm Mediplantex HÀ NỘI-2014 HÀ NỘI-2014 LỜI CẢM ƠN Vi lng knh trng v bit ơn sâu sc tôi xin đưc by t lời cm ơn chân thnh ti: ThS. Phùng Minh Dũng, CN.Vũ Tùng Lâm v các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân Tch, những người đã nhiệt tình ging dạy tôi về c lý thuyt v thực hnh, trực tip cung cấp, góp ý cho tôi những thông tin, kin thức rất hữu ch đ tôi có th hon thnh đưc khóa luận ny. TS. Trần Việt Hùng, Phó viện trưởng Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong sut quá trình nghiên cứu v th nghiệm thực t trên cá Nóc. TS. Bùi Hồng Cường, Ging viên Bộ môn Dưc Cổ Truyền, một người thầy đáng knh trong công việc cng như trong cuộc sng. Thầy đã định hưng v cho tôi những lời khuyên bổ ch đ tôi hon thnh khóa luận ny. Dược sĩ Dương Minh Tân đã trực tip hưng dẫn, ch bo v tạo mi điều kiện thuận li cho tôi trong quá trình lm việc, nghiên cứu v thu thập s liệu thực t trên cá Nóc đ tôi có th hon thnh đưc khóa luận. Xin chân thnh cm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phng đo tạo Trường Đại hc Dưc H Nội đã tạo mi điều kiện thuận li cho tôi trong quá trình hc tập v hon thnh khóa luận. Xin chân thnh cm ơn gia đình, người thân v bạn bè đã luôn  bên cạnh động viên v giúp đỡ tôi hc tập, lm việc v hon thnh khóa luận tt nghiệp. H Nội, ngy 07 tháng 5 năm 2014 SINH VIÊN Hoàng Thanh Hà MC LC TRANG PH BÌA LỜI CẢM ƠN MC LC DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MC CÁC BẢNG DANH MC CÁC HÌNH Trang ĐT VN Đ 1 Chương 1: TNG QUAN 2 1.1 Tổng quan về cá Nóc và Tetrodotoxin 2 1.1.1 Cá Nóc 2 1.1.2. Tetrodotoxin 3 1.1.3. Phương pháp xử lý mẫu trong các bộ phận khác nhau của cá Nóc để định lượng Tetrodotoxin: Kỹ thuật chiết và làm giàu mẫu bằng chiết pha rắn (SPE) 7 1.1.4. Các phương pháp định lượng Tetrodotoxin 9 1.2. Tổng quan về sắc khí lỏng khối phổ 10 1.2.1. Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ 10 1.2.2. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ 12 1.2.3. Một số kỹ thuật LC-MS 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 19 2.1.1 Nguyên vật liệu 19 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 2.2. Nội dung nghiên cứu 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1. Chuẩn bị mẫu 21 2.3.2. Tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX 23 2.3.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định lượng TTX 23 2.3.4. Đánh giá phương pháp. 24 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Chuẩn bị mẫu 27 3.1.1. Mẫu chuẩn 27 3.1.2. Mẫu thử 27 3.2. Tối ưu hoá điều kiện khối phổ đối với TTX 28 3.3. Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để định lượng 29 3.3.1 Khảo sát điều kiện sắc ký 29 3.4. Đánh giá sự phù hợp của hệ thống LC-MS 35 3.5. Áp dụng phương pháp để định lượng một số mẫu cá Nóc bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS 41 3.6. Bàn luận 41 3.6.1. Về quy trình chiết tách và xử lý mẫu 41 3.6.2. Về phương pháp phân tích LC/MS 41 3.6.3. Về kết quả định lượng một số mẫu cá Nóc 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization (Kỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển) APPI Atmospheric Pressure Photoionization (Kỹ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) ESI Electro Spray ionization (Kỹ thuật ion hóa bằng phun điện tử) FLD Fluorescence Detector (Đầu dò huỳnh quang) GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) LC-MS Liquid Chromatography- Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) MLD Mean Lethal Dose (Liều gây chết trung bình) SIM Selected Ion Monitoring (Kỹ thuật phân tích chọn lọc ion) SPE Solid Phase Extraction (Chiết pha rắn) SRM Selected Reaction Monitoring (Chọn lọc ion con sau phản ứng) TIC Total Ion Chromatogram (Sắc đồ toàn ion) TTX, UV Tetrodotoxin, Ultra Violet (Tia cực tím) AG, SG Auxiliary Gas (khí bổ trợ), Sheath Gas (khí thổi) RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) DANH MC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống Tr.35 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp Tr.35 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp Tr 39 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Tr.40 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát LOD và LOQ của phương pháp Tr.40 Bảng 3.6 Kết quả định lượng một số mẫu cá Nóc Tr.41 DANH MC CÁC HÌNH Hình 1.1 Ảnh hai trong số các loài Nóc độc Tr.3 Hình 1.2 Cấu trúc phân tử Tetrodotoxin Tr.4 Hình 1.3 Cơ chế epimer hóa nhóm OH C-4 của Tetrodotoxin Tr.5 Hình 1.4 Cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Tr.10 Hình 1.5 Thí nghiệm xác định đồng vị Neon của F.W Aston năm 1913 Tr.11 Hình 1.6 Sơ đồ khối cấu tạo thiết bị LC/MS-MS (nguồn ion hoá kiu ESI – kt ni phun sương) Tr.14 Hình 1.7 Kỹ thuật Electrospray Ionization Tr.16 Hình 2.1 Nội tạng cá Nóc được mổ lấy ra để đem đi xử lí Tr.19 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình xử lí mẫu, chiết và làm giàu Tr.22 Hình 3.1 Kết quả tối ưu hóa điều kiện khối phổ đối với TTX Tr.29 Hình 3.2 Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký A Tr.30 Hình 3.3 Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký B Tr.31 Hình 3.4 Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký C Tr.32 Hình 3.5 Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký D Tr.33 Hình 3.6 Sắc ký đồ với điều kiện sắc ký E Tr.34 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ TTX và diện tích peak Tr.36 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch mẫu trắng Tr.37 Hình 3.9 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn TTX nồng độ 10µg/mL Tr.37 Hình 3.10 Sắc ký đồ dung dịch thử Tr.38 Hình 3.11 Hai loài Lagocephalus lunaris và Arothran hispidus Tr.43 1 ĐT VN Đ Mặc dù các phương tiện thông tin đại chúng đã nói rất nhiều về mối nguy hiểm của cá Nóc tới tính mạng con người nhưng số nạn nhân tử vong do ăn cá Nóc ở nước ta vẫn không hề giảm, đặc biệt là ở các tỉnh duyên hải miền Trung. Độc tố trong cá Nóc có thành phần chủ yếu là Tetrodotoxin (TTX), thuộc nhóm độc tố thần kinh cực kỳ nguy hiểm, khả năng gây tử vong cao [15]. Tuy nhiên không phải loài cá Nóc nào cũng độc, hàm lượng độc tố khác nhau ở các loài cá Nóc khác nhau và ở các bộ phận khác nhau của cá. Hàm lượng độc tố trong cơ thể còn thay đổi theo mùa, vùng địa lý và giai đoạn phát triển của cá thể [6]. Độc tố trong cá Nóc hiện được nhiều nước trên thế giới nghiên cứu, đặc biệt là Nhận Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc. Chúng được dùng trong y dược, nghiên cứu khoa học và lĩnh vực khác. Do vậy, chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu phát hiện và xây dựng quy trình định lượng độc tố của một số loài cá Nóc biển Việt Nam có khả năng ứng dụng trong y học (làm thuốc), trong đó đặc biệt quan tâm đến tetrodotoxin. Sắc ký lỏng khối phổ hiện đang là phương pháp phổ biến, với nhiều ưu điểm như độ nhạy cao, chính xác, vì vậy, ứng dụng phương pháp này để định lượng độc tố TTX với một hàm lượng nhỏ là hết sức phù hợp và cần thiết. Từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu định lượng Tetrodotoxin trong phủ tạng cá Nóc bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)” với các mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng Tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ. - Áp dụng phương pháp xây dựng được để định lượng Tetrodotoxin trong phủ tạng cá Nóc. 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 TNG QUAN V C NC V TETRODOTOXIN 1.1.1 Cá nóc [3], [7], [8], [9], [17], [28], [29], [30]. Bộ Cá nóc (tên khoa học là Tetraodontiformes) chứa 10 họ còn sinh tồn với khoảng 360 loài và khoảng 9 họ đã tuyệt chủng [17]. Phần lớn các loài là cá nước mặn và sinh sống trong hay xung quanh các bãi đá san hô ngầm vùng nhiệt đới, nhưng có vài loài là các nước ngọt, sinh sống trong sông suối hay cửa sông. Các hình dạng kỳ dị được thấy trong bộ cá này: có thể gần như là hình vuông hay tam giác (các loài cá nóc hòm), hình cầu (các loài cá nóc) cho tới dẹp bên (các loài cá đầu) [3]. Cá nóc phòng thủ bằng cách hy sinh tốc độ: ở loài này lớp vảy đã biến đổi thành các tấm hay các gai cứng. Các gai này đôi khi có thể thụt vào và có thể khóa tại chỗ (như ở các loài cá nóc gai), hay với lớp da dai như da thú (các loài cá đầu và cá bò giấy). Một đặc điểm phòng ngự đáng chú ý khác được thấy ở các loài cá nóc và cá nóc nhím là khả năng phình to cơ thể, để tăng các kích thước so với hình dáng thông thường. Nhiều loài của các họ Tetraodontidae (cá nóc bốn răng), Triodontidae (cá nóc ba răng) và Diodontidae (cá nóc nhím) còn có khả năng tự bảo vệ (thêm) chống các kẻ ăn thịt nhờ tetraodotoxin (TTX), một chất độc thần kinh cực mạnh hiện chưa có thuốc giải, tập trung chủ yếu trong các cơ quan nội tạng [9]. Tại Việt Nam, cá Nóc phân bố dọc bờ biển từ Bắc vào Nam, tập trung nhiều ở ven biển miền Trung. Theo kết quả điều tra sơ bộ của Viện Nghiên cứu Hải sản, có khoảng 46 loài trong 4 họ (Diodontidae, Ostraciidae, Tetraodontidae, Triodontidae) sống ở biển, trong đó họ Cá nóc (Tetraodontidae) là chủ yếu, chiếm khoảng 85%. [...]... một khối phổ đồ hoặc phổ khối Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất  Nhiệm vụ của detector khối phổ - Trong phân tích định tính: Khi ghép với thiết bị sắc ký lỏng, chất phân tích được xác nhận bằng: + Sắc ký đồ ở thời gian lưu xác định tR đặc trưng cho chất phân tích 14 + Phổ khối tương ứng của hoá chất phân tích hoặc phổ khối. .. cho HPLC (Merck) 21 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xây dựng quy trình xử lý mẫu - Tối ưu hóa điều kiện khối phổ, khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng Tetrodotoxin bằng sắc lý lỏng khối phổ (LC- MS) - Đánh giá phương pháp - Áp dụng phương pháp để định lượng một số mẫu phủ tạng cá Nóc 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Chuẩn bị mẫu Bao gồm mẫu chuẩn và mẫu thử: * Mẫu chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn từ chất chuẩn... * Sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS) là sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và detector khối phổ (MS) Trong kỹ thuật LC-MS , hỗn hợp các chất trong pha động sau khi được tách qua cột sắc ký sẽ được phát hiện bằng detector khối phổ Trong phân tích dược phẩm, người ta thường sử dụng phương pháp LC-MS cho: - Các hợp chất tương đối phân cực đến phân cực nhiều, khó bay hơi - Phân tích thuốc trong. .. Aston (nhà bác học đạt giải Nobel năm 1922 cho các nghiên cứu đồng vị) 11 đã nghiên cứu thấy khí neon tự nhiên gồm 2 loại có khối lượng nguyên tử khác nhau (isotope) là 20 và 22 (g/mol) Hàng loạt các nghiên cứu về phương pháp phổ khối lượng như cơ chế và kỹ thuật ion hoá, thiết bị phân tích phổ khối và các ứng dụng của phương pháp phổ khối lượng trong các lĩnh vực hoá học, vật lý, sinh học, …đã được... MS 2 lần (MS /MS), chế độ SRM, lựa chọn mảnh m/z = 320 → 162 Thiết lập các điều kiện khối phổ: Nguồn ion hóa (+ESI), khí thổi (SG), khí bổ trợ (AG), nhiệt độ hóa hơi, nhiệt độ mao quản, thế ion hóa 2.3.3 Xây dựng chương trình sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS) để định lượng TTX Khảo sát để tìm điều kiện sắc ký như cột, pha động, tốc độ dòng, điều kiện khối phổ cho chương trình sắc ký LC-MS định lượng TTX 2.3.4... định đồng vị Neon của F.W Aston năm 1913 Ngày nay, phương pháp phân tích phổ khối lượng có ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành với các ứng dụng chính như: Xác định khối lượng, cấu trúc phân tử; Nhận dạng, định danh và cấu trúc chuỗi peptip, protein; Nghiên cứu đồng vị; Định tính, định lượng các chất nồng độ vết và vi lượng trong các mẫu sinh học, thực phẩm, dược phẩm, nông thuỷ sản, môi trường * Sắc. .. thuật định lượng khá chính xác được chúng tôi áp dụng trong khóa luận này 19 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 2.1.1 Nguyên vật liệu Nội tạng cá Nóc (trứng, gan, ruột) thu mua ở Nha Trang – Khánh Hòa được bảo quản đông lạnh Xử lí, chiết và làm giàu mẫu bằng chiết pha rắn (SPE) để có thể định lượng hàm lượng TTX trong mẫu cá Nóc Hình 2.1 Nội tạng cá Nóc được... sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography mass spectrometry) 1.2 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ 1.2.1 Một số nét sơ lược về sắc ký lỏng khối phổ [4], [15], [20], [23], 25], [26] *Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry - MS) là một phương pháp phân tích dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất Bắt đầu từ cuối thế kỷ XIX, Goldstein (1886) và Wein (1898) thấy rằng... Phương pháp sắc ký lỏng với các detector UV, FLD, MS [20],[27] Sắc kí lỏng hiệu năng cao là phương pháp dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất lỏng được bao trên bề mặt của các hạt chất... độ các ion sinh ra từ một ion xác định của chất phân tích Như vậy việc nhận danh thông qua vừa thời gian lưu, vừa phổ khối sẽ chắc chắn hơn là chỉ dựa vào thời gian lưu - Trong phân tích định lượng: Do đặc thù của detector như đã nêu, giúp cho định lượng đúng đối tượng và có độ nhạy cao  Các bộ phận của detector khối phổ [1], [4], [12], [19], [26] - Bộ phận nạp mẫu: Đưa mẫu vào máy Trong máy sắc ký . tài Nghiên cứu định lượng Tetrodotoxin trong phủ tạng cá Nóc bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC/MS)” với các mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng Tetrodotoxin bằng sắc ký lỏng khối phổ. . TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TETRODOTOXIN TRONG PHỦ TẠNG CÁ NÓC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng. ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  HOÀNG THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TETRODOTOXIN TRONG PHỦ TẠNG CÁ NÓC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2014