BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Thị Thuận Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Để đạt đƣợc kết quả nhƣ ngày hôm nay, xin cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới những ngƣời đã hƣớng dẫn, giúp đỡ và luôn ở bên tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn đầu tiên tới TS. Nguyễn Thị Thuận, giảng viên bộ môn Hóa Dƣợc – trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn cho tôi thực hiện đề tài này. Cùng với tri thức và tâm huyết của mình, cô đã truyền đạt cho tôi vốn kiến thức quý báu, lòng say mê công việc, tác phong làm việc nghiêm túc, khoa học Em xin cảm ơn cô! Tôi cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các thầy cô và anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Hóa Dƣợc trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, các anh chị trong khoa Vật lý đo lƣờng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ƣơng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đƣợc khóa luận. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè là những nguồn cổ vũ tinh thần lớn lao, đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, 5/2014 Sinh viên Phạm Kim Anh MỤC LỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Trang Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu. 2 1.1.1. Vài nét về các vitamin B 1 , B 6 , B 12 2 1.1.1.1. Vitamin B 1 (Thiamin) 2 1.1.1.2. Vitamin B 6 (Pyridoxin) 2 1.1.1.3. Vitamin B 12 (Cobalamin) 3 1.1.2. Một số chế phẩm chứa vitamin B 1 , B 6 , B 12 trên thị trƣờng 4 1.1.3. Một số phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đang đƣợc sử dụng hiện nay 5 1.2. Cơ sở lý thuyết chung của phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 6 1.2.1. Nguyên lý chung của TLC 6 1.2.2. Pha tĩnh trong TLC 7 1.2.3. Pha động trong TLC. 7 1.2.4. Các bƣớc tiến hành định lƣợng bằng TLC 8 1.2.4.1. Chuẩn bị bản mỏng 8 1.2.4.2. Đƣa mẫu phân tích lên bản mỏng 8 1.2.4.3. Khai triển sắc ký với pha động phù hợp 8 1.2.4.4. Phát hiện các vết trên sắc ký đồ 9 1.2.5. Ứng dụng của TLC 10 1.3. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) 10 1.4. Vài nét về bán định lƣợng (Semiquantitative) 12 1.4.1. Khái niệm bán định lƣợng 12 1.4.2. Bán định lƣợng bằng HPTLC với phần mềm VideoScan 12 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, dung môi hóa chất và dụng cụ. 14 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu. 14 2.1.2. Dung môi, hóa chất, thuốc thử. 15 2.1.3. Dụng cụ, trang thiết bị. 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện phát hiện 16 2.2.2. Đánh giá phƣơng pháp 17 2.2.2.1. Tính chọn lọc – đặc hiệu 17 2.2.2.2. Đƣờng chuẩn và khoảng tuyến tính 17 2.2.2.3. Độ lặp lại 18 2.2.2.4. Độ đúng 18 2.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp trên một số chế phẩm thuốc lƣu hành trên thị trƣờng 19 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu. 19 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 21 3.1. Chuẩn bị mẫu trắng, dung dịch chuẩn và thử. 21 3.1.1. Pha mẫu trắng và dung dịch chuẩn gốc 21 3.1.2. Pha dung dịch chuẩn 21 3.1.3. Pha dung dịch thử 22 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 22 3.2.1. Khảo sát thành phần pha động 22 3.2.2. Lựa chọn bƣớc sóng phát hiện 24 3.2.3. Khảo sát thể tích dung dịch mẫu đƣa lên bản mỏng và các điều kiện sắc ký khác. 24 3.3. Đánh giá phƣơng pháp phân tích 26 3.3.1. Bán định lƣợng B 1 và B 6 26 3.3.1.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc 26 3.3.1.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính. 27 3.3.1.3. Độ lặp lại và độ đúng. 29 3.3.2. Bán định lƣợng B 12 32 3.3.2.1. Độ đặc hiệu – chọn lọc 32 3.3.2.2. Đƣờng chuẩn – khoảng tuyến tính 33 3.3.2.3. Độ lặp lại và độ đúng 35 3.4. Ứng dụng bán định lƣợng vitamin trong một số chế phẩm thuốc 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT AOAC : Hiệp hội các nhà hoá phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists) CT CPDP : Công ty cổ phần dƣợc phẩm CT TNHH : : Công ty trách nhiệm hữu hạn EtOH : Ethanol HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) HPTLC : Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography) Pyridoxin .HCl : Pyridoxin hydroclorid r : Hệ số tƣơng quan R f : Hệ số lƣu giữ RSD : Độ lệch chuẩn tƣơng đối (Relative Standard Deviation). Thiamin .HCl : Thiamin hydroclorid TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography). USP : Dƣợc điển Mỹ (United States Pharmacopoea). UV : Tử ngoại (Ultra Violet). VIS : Khả kiến (Visible). DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1: Các phƣơng pháp định lƣợng hỗn hợp vitamin 3B thƣờng dùng và ƣu nhƣợc điểm 5 Bảng 1.2: So sánh một số tham số của TLC và HPTLC 11 Bảng 2.1: Các chế phẩm đƣợc nghiên cứu trong khóa luận 14 Bảng 2.2: Các chế phẩm đƣợc áp dụng phƣơng pháp phân tích 15 Bảng 3.1: Kết quả phân tích vitamin B 1 , B 6 trên dãy dung dịch chuẩn 28 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại – B 1 , B 6 30 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát độ đúng – B 1 , B 6 31 Bảng 3.4: Kết quả phân tích vitamin B 12 trên dãy dung dịch chuẩn 34 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ lặp lại – B 12 36 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng – B 12 37 Bảng 3.7: Phần trăm hàm lƣợng các vitamin trong các chế phẩm so với nhãn 38 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC 11 Hình 3.1: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 1 23 Hình 3.2: Sắc ký đồ khi triển khai bằng pha động 2 23 Hình 3.3: Vị trí chấm mẫu trên bản mỏng HPTLC silica gel 60 F254 kích thƣớc 20 x 10 cm 25 Hình 3.4: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B 1 , B 6 khi soi dƣới đèn UV ở bƣớc sóng 366 nm 26 Hình 3.5: Sắc ký đồ một vết của đƣờng chuẩn B 1 và B 6 thu đƣợc với phần mềm VideoScan 27 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn vitamin B 1 28 Hình 3.7: Đƣờng chuẩn vitamin B 6 29 Hình 3.8: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng của B 1 và B 6 ở bƣớc sóng 366 nm 30 Hình 3.9: Sắc ký đồ thử độ đặc hiệu – B 12 khi quan sát dƣới ánh sáng khả kiến 32 Hình 3.10: Sắc ký đồ một vết của đƣờng chuẩn B 12 thu đƣợc với phần mềm VideoScan 33 Hình 3.11: Đƣờng chuẩn vitamin B 12 34 Hình 3.12: Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại và độ đúng của B 12 ở ánh sáng khả kiến 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, trên thị trƣờng có rất nhiều loại thuốc chứa hỗn hợp các vitamin, hay gặp là dạng kết hợp các vitamin nhóm B. Theo thống kê từ danh mục thuốc đã đƣợc cấp số đăng ký của Cục Quản lý Dƣợc Việt Nam, từ tháng 7/2009 đến tháng 1/2014 có gần 500 chế phẩm thuốc multivitamin đã đƣợc cấp số đăng ký lƣu hành trên thị trƣờng, trong đó khoảng 150 thuốc có thành phần kết hợp 3 loại vitamin: B 1 , B 6 , B 12 [2]. Vitamin là nhóm chất rất dễ bị phân hủy bởi nhiều tác nhân lý hóa (nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, các ion kim loại ) làm giảm hàm lƣợng trong thuốc theo thời gian và điều kiện bảo quản. Vì vậy, công tác kiểm tra chất lƣợng của các thuốc chứa vitamin nói riêng và các thuốc nói chung rất cần đƣợc quan tâm. Các phƣơng pháp hay đƣợc dùng để định lƣợng hỗn hợp vitamin hiện nay là HPLC [3], quang phổ UV – VIS [4], [13]. Phƣơng pháp TLC mới chỉ đƣợc sử dụng chủ yếu với mục đích định tính, thử tinh khiết. Tuy nhiên, từ khi xuất hiện HPTLC, một kỹ thuật cải tiến của TLC thì việc sử dụng HPTLC để định lƣợng/bán định lƣợng hoạt chất đã trở nên phổ biến hơn. Áp dụng kỹ thuật HPTLC để định lƣợng/bán định lƣợng các vitamin trong hỗn hợp có một số ƣu điểm nhƣ: tính đặc hiệu cao, đơn giản, dễ thực hiện, định lƣợng đƣợc đồng thời nhiều vitamin trong hỗn hợp, tiết kiệm thời gian, hóa chất. Vì vậy, để đóng góp thêm một phƣơng pháp kiểm tra sơ bộ chất lƣợng thuốc hỗn hợp vitamin cho các nhà sản xuất, kinh doanh thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bán định lƣợng một số vitamin trong hỗn hợp bằng phƣơng pháp HPTLC” với các mục tiêu: 1. Xây dựng phƣơng pháp bán định lƣợng các vitamin B 1 , B 6 , B 12 trong hỗn hợp bằng HPTLC. 2. Đánh giá phƣơng pháp vừa xây dựng. [...]... về bán định lƣợng (Semiquantitative) 1.4.1 Khái niệm bán định lƣợng - Bán định lƣợng là xác định một cách gần đúng hàm lƣợng của một chất, kết quả bán định lƣợng rơi vào khoảng giữa của một kết quả định lƣợng và một kết quả định tính [8] - Phân tích bán định lƣợng tƣơng tự nhƣ phân tích định tính trong việc phát hiện sự có mặt hay vắng mặt của một chất phân tích, nhƣng sau đó đi vào để cung cấp một. .. tƣợng nghiên cứu Mặc dù trên thị trƣờng có rất nhiều các chế phẩm multivitamin mà thành phần là hỗn hợp nhiều vitamin, thậm chí có chế phẩm chứa tới 9 – 10 loại vitamin khác nhau, nhƣng trong khuôn khổ có hạn của khóa luận, chúng tôi chỉ nghiên cứu bán định lƣợng các vitamin B1, B6, B12 trong các chế phẩm thuốc chứa 3 loại vitamin này 1.1.1 Vài nét về các vitamin B1, B6, B12 [6], [13] 1.1.1.1 Vitamin. .. lƣợng các chất trong mẫu phân tích (bán định lƣợng) 14 Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu, dung môi hóa chất và dụng cụ 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu thử là một chế phẩm chứa vitamin B1, B6, B12 trên thị trƣờng và một chế phẩm không chứa các vitamin này đƣợc dùng làm mẫu trắng (bảng 2.1): Bảng 2.1: Các chế phẩm được nghiên cứu trong khóa luận Tên Dạng Thành phần,... ra, hiện nay phƣơng pháp điện di mao quản cũng đã đƣợc nghiên cứu để định lƣợng hỗn hợp các vitamin tan trong nƣớc [5] Kỹ thuật HPTLC đã khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của các phƣơng pháp định lƣợng trên, đó là thao tác phức tạp, thời gian tiến hành lâu (HPLC, phƣơng pháp định lƣợng riêng từng thành phần) hoặc không định lƣợng đƣợc mẫu có thành phần phức tạp (UV – VIS) Lý do là HPTLC có thao tác đơn... dùng loại chuyên dụng, - Định lƣợng đƣợc tốn nhiều dung môi) hỗn hợp nhiều - Thời gian phân tích lâu thành phần - Dễ tắc cột, khó bảo dƣỡng thiết bị Định lƣợng riêng - Có thể áp dụng cho - Cần thực hiện nhiều thao tác, từng vitamin sử dụng hỗn hợp chứa cả tốn công sức và thời gian kết hợp nhiều phƣơng vitamin tan trong pháp: quang phổ hấp dầu và vitamin tan thụ UV, phƣơng pháp trong nƣớc hóa học [12]... phân tích hấp thụ bức xạ đƣợc ghi lại thành pic sắc ký 1.2.4.5 Định lƣợng các chất trong vết sắc ký Có hai phƣơng pháp định lƣợng các chất trong vết sắc ký: - Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp, làm sạch dịch chiết rồi định lƣợng chất phân tích bằng phƣơng pháp thích hợp - Định lƣợng trực tiếp trên bản mỏng bằng cách đo diện tích hay cƣờng độ màu của vết sắc ký, sử dụng... chuyên dụng (Hình 1.1) 11 Máy tính có phần mềm VideoScan Máy chấm mẫu tự động Buồng chụp Bình triển khai sắc ký Hình 1.1: Một hệ thống máy móc HPTLC Bảng 1.2 sau đây sẽ giúp so sánh một số tham số của TLC và HPTLC: Bảng 1.2 So sánh một số tham số của TLC và HPTLC Tham số HPTLC TLC Bán tự động Thủ công Kích thƣớc hạt 5 – 6 µm 10 – 12 µm Độ dày lớp pha tĩnh 100 µm 250 µm Chiều cao đĩa lý thuyết 12 µm 30... lƣợng hỗn hợp vitamin 3B đang đƣợc sử dụng hiện nay (bảng 1.1) Bảng 1.1: Các phương pháp định lượng hỗn hợp vitamin 3B thường dùng và ưu nhược điểm Phƣơng pháp định lƣợng Ƣu điểm chính - Tiến hành nhanh Quang phổ UV-VIS [3] - Cho kết quả có độ chính xác cao Nhƣợc điểm chính - Chỉ định lƣợng đƣợc hỗn hợp chứa 2-3 thành phần, không định lƣợng đƣợc đồng thời nhiều hoạt chất - Không đặc hiệu - Dung môi, hóa... một con số đại diện của hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu vật có liên quan đến các ngƣỡng bình thƣờng/không bình thƣờng - WHO thƣờng không đƣa ra các tài liệu tham khảo đối với kết quả phân tích bán định lƣợng, và phạm vi ứng dụng của bán định lƣợng có thể khác nhau đáng kể giữa các phòng thí nghiệm [20] 1.4.2 Bán định lƣợng bằng HPTLC với phần mềm VideoScan - Khi định lƣợng các chất bằng HPTLC, độ... camera kỹ thuật số: quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, ví dụ camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký, sau đó xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính 1.2.5 Ứng dụng của TLC TLC đƣợc ứng dụng trong định tính, thử tinh khiết, định lƣợng, bán định lƣợng các chất trong hỗn hợp nhiều thành phần 1.3 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Về nguyên tắc cơ bản, HPTLC không . pháp kiểm tra sơ bộ chất lƣợng thuốc hỗn hợp vitamin cho các nhà sản xuất, kinh doanh thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu bán định lƣợng một số vitamin trong hỗn hợp bằng phƣơng pháp. BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM KIM ANH NGHIÊN CỨU BÁN ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ VITAMIN TRONG HỖN HỢP BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014