BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THANH TÙNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NÉN ALPHA-CHYMOTRYPSIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THANH TÙNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA VIÊN NÉN ALPHA-CHYMOTRYPSIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thạch Tùng TS Nguyễn Thị Liên Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Bộ môn Công nghiệp dược Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Thạch Tùng, người tận tình hướng dẫn giúp đỡ em trình hồn thành khóa luận Dưới hướng dẫn thầy, em học hỏi nhiều điều, không kiến thức mà đam mê với khoa học Em chân thành cám ơn TS Nguyễn Thị Liên cán phòng Dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương Sự hướng dẫn giúp đỡ nhiệt tình anh chị giúp em có điều kiện hồn thành khóa luận cách thuận lợi Trong trình làm thực nghiệm nghiên cứu, em nhận giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô giáo, kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế Bộ môn Công nghiệp Dược Em xin cám ơn giúp đỡ quý báu Cuối em xin cám ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu học tập Hà Nội, tháng năm 2014 Sinh viên Phạm Thanh Tùng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG – TỔNG QUAN 1.1 Đại cương alpha-chymotrypsin 1.1.1 Nguồn gốc, cấu tạo 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Phương pháp định lượng 1.1.4 Đơn vị tính 1.1.5 Tác dụng dược lý 1.1.6 Chỉ định 1.1.7 Liều lượng cách dùng 1.1.8 Tác dụng không mong muốn 1.1.9 Chế phẩm 1.2 Độ ổn định phương pháp cải thiện độ ổn định enzym 1.2.1 Quá trình bất hoạt enzym 1.2.2 Các tác nhân gây bất hoạt enzym 1.2.3 Các phương pháp cải thiện độ ổn định enzym 10 1.3 Đại cương đông khô 11 1.3.1 Khái niệm 11 1.3.2 Ảnh hưởng giai đoạn đông khô tới hoạt tính enzym 11 1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định chế phẩm sinh học 13 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp bào chế 17 2.3.2 Phương pháp đánh giá 20 CHƯƠNG - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Nghiên cứu bào chế bột đông khô alpha – chymotrypsin 26 3.1.1 Ảnh hưởng yếu tố công thức 26 3.1.2 Ảnh hưởng yếu tố quy trình 37 3.1.3 Đánh giá hoạt tính bột đơng khơ 38 3.2 So sánh bột đông khô ACT với nguyên liệu ACT ban đầu 38 3.2.1 Khả ổn định với chu trình nhiệt-lạnh 39 3.2.2 Khả ổn định với yếu tố nhiệt-ẩm 39 3.2.2 Khả ổn định tác động lực học 41 3.3 Nghiên cứu bào chế viên nén chứa bột đông khô alphachymotrypsin 42 3.3.1 Lựa chọn phương pháp bào chế 42 3.3.2 Ảnh hưởng tá dược độn 43 3.3.3 Ảnh hưởng lực dập 45 3.4 Đánh giá độ ổn định viên nén alpha-chymotrypsin 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ACT Alpha-chymotrypsin BĐK Bột đông khô DĐVN IV Dược điển Việt Nam IV USP Dược điển Mỹ ATEE N-acetyl-L-tyrosin ethyl este CT Công thức PBS Đệm phosphat DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Các loại chế phẩm thị trường alpha-chymotrypsin Bảng 1.2 Phân loại dạng biến đổi cấu trúc alpha-chymotrypsin Bảng 1.3 Ảnh hưởng pH đến trạng thái alpha-chymotrypsin Bảng 1.4 Các phương pháp cải thiện độ ổn định alphachymotrypsin Bảng 1.5 Các nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông khô để tăng độ ổn định chế phẩm sinh học năm gần 10 14 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu 16 Bảng 3.1 Khảo sát tá dược tạo thể chất 26 Bảng 3.2 Thể chất hàm ẩm bánh đông khô bột đông khô sử dụng tá dược tạo thể chất khác Bảng 3.3 Bảng khảo ảnh hưởng tá dược A môi trường đệm 7,8 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng tá dược A tới độ tan pH ACT môi trường pH 7,8 Bảng 3.5 Bảng khảo sát ảnh hưởng tá dược A với yếu tố biến tính Bảng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng tá dược A tới hàm ẩm bột đông khô Bảng 3.7 Khảo sát độ tan ACT có mặt tá dược A 80oC 27 29 30 31 33 34 Bảng 3.8 Khảo sát ảnh hưởng chất diện hoạt 35 Bảng 3.9 Khảo sát số thơng số quy trình 37 Bảng 3.10 Hoạt tính alpha-chymotrypsin trước sau đông khô 38 Bảng 3.11 Hàm ẩm hoạt tính cịn lại ACT ACT đơng khơ sau chu trình nhiệt lạnh 39 Bảng 3.12 Hàm ẩm hoạt tính alpha-chymotrypsin alphachymotrypsin đơng khô điều kiện nhiệt độ 40oC, hàm ẩm 75% theo 40 thời gian Bảng 3.13 Hoạt tính cịn lại viên nén chứa alpha-chymotrypsin đông khô viên nén alpha-chymotrypsin sau dập Bảng 3.14 Góc trơn chảy khối bột Bảng 3.15 Hoạt tính hoạt tính lại viên nén sử dụng isomalt, tá dược C carrageenan thời điểm khác Bảng 3.16 Hoạt tính hoạt tính cịn lại viên nén sử dụng mức lực khác Bảng 3.17 Kết khảo sát độ ổn định công thức tối ưu 41 42 43 45 47 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình vẽ Hình 1.1 Cấu trúc chiều phân tử alpha chymotrypsin Hình 1.2 Đường biểu diễn động học trình bất hoạt alphachymotrypsin Trang Hình 1.3 Ảnh hưởng pH đến α-chymotrypsin Hình 1.4 Ảnh hưởng pH đến α-chymotrypsin Hình 1.5 Các giai đoạn trình đơng khơ 11 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình bào chế bột đơng khơ alpha chymotrypsin 17 Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt quy trình bao chế viên nén alphachymotrypsin 19 Hình 3.1 Thể chất bánh đơng khô sử dụng loại tá dược độn khác môi trường PBS 7,8 HCl 0,001N 28 Hình 3.2 Trạng thái hịa tan trở lại mẫu đơng khơ 32 Hình 3.3 Độ tan alpha-chymotrypsin mơi trường khác 33 Hình 3.4 Độ tan ACT sau gây biến tính nhiệt độ 80oC 34 Hình 3.5 Thể chất bánh đông khô sử dụng loại chất diện hoạt khác 36 Hình 3.6 Hoạt tính cịn lại alpha-chymotrypsin alphachymotrypsin đông khô điều kiện nhiệt độ 40 ± oC, hàm ẩm 75 ± 5% theo thời gian 40 Hình 3.7 Hoạt tính cịn lại viên nén sử dụng loại tá dược độn khác theo thời gian lão hóa cấp tốc điều kiện 40 ± oC, hàm ẩm 75 ± 5% 44 Hình 3.8 Hoạt tính cịn lại viên nén alpha-chymotrypsin sau dập với mức lực khác 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Với phát triển mạnh mẽ ngành công nghệ sinh học đại, việc ứng dụng chất có nguồn gốc sinh học vào điều trị hướng hứa hẹn mang lại hiệu cao Nhiều chất đóng vai trị quan trọng cơng tác điều trị bệnh insulin, γ-interferon, α-chymotrypsin,… Tuy nhiên, việc phát triển chế phẩm chứa chất có nguồn gốc sinh học lại gặp phải trở ngại lớn, độ ổn định Sự hoạt tính nhanh chóng dược chất đặt tốn khó để ứng dụng rộng rãi chế phẩm sinh học vào thực tế điều trị Alpha-chymotrypsin enzym sinh học thường thương mại hóa dạng viên nén để điều trị triệu chứng viêm Tuy nhiên, vấn đề thường gặp phải chế phẩm khó trì hoạt tính cần thiết sau thời gian lưu hành thị trường Điều thân alpha-chymotrypsin nhạy cảm với yếu tố môi trường, đặc biệt điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Việt Nam Việc khắc phục nhược điểm thu hút quan tâm ý nhà sản xuất nhà nghiên cứu Xuất phát từ thực tế nêu trên, đề tài “Nghiên cứu bào chế đánh giá độ ổn định viên nén alpha-chymotrypsin” tiến hành với mục tiêu: Xây dựng cơng thức quy trình bào chế viên nén alpha-chymotrypsin có khả trì độ ổn định cao trình bào chế bảo quản ban đầu 39 nguyên liệu với tác nhân gây bất hoạt enzym thường gặp trình sản xuất viên nén : chu trình nhiệt-lạnh, yếu tố nhiệt-ẩm lực học 3.2.1 Khả ổn định với chu trình nhiệt-lạnh Nhiệt yếu tố gây bất hoạt enzym Tăng nhiệt độ làm tăng tốc độ mức độ bất hoạt enzym Trên thực tế, dao động nhiệt độ lớn thời tiết Việt Nam yếu tố ảnh hưởng lớn tới độ ổn định chế phẩm viên nén alpha-chymotrypsin Do đó, chúng tơi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng chu trình nhiệt lạnh tới độ ổn định ACT ACT đông khô Sau chu trình nhiệt lạnh (80oC 24 giờ) (-20oC 24 giờ), kết thu bảng: Bảng 3.11 Hàm ẩm hoạt tính cịn lại ACT ACT đơng khơ sau chu trình nhiệt lạnh Hàm ẩm (%) Hoạt tính ban đầu (đơn vị USP/mg) ACT 7,50 1694,00 Hoạt tính sau chu trình nhiệt-lạnh (đơn vị USP/mg) 900,19 ACT đông khô 0,85 124,00 124,81 Hoạt tính cịn lại (%) 53,14 % 100,66% Nhận xét: Từ kết ta nhận thấy: alpha-chymotrypsin dạng đông khơ có khả ổn định hoạt tính tốt dạng ban đầu với yếu tố nhiệt Sau chu trình nhiệt-lạnh, alpha-chymotrypsin đơng khơ khơng bị hoạt tính hoạt tính alpha chymotrypsin cịn nửa Nguyên nhân điều hàm ẩm alpha-chymotrypsin đông khô thấp so với dạng ban đầu Hàm ẩm thấp hạn chế hoạt tính enzym thay đổi nhiệt độ [13][38] Ngồi ra, liên kết hydro hình thành enzym manitol giúp cải thiện độ ổn định enzym với nhiều yếu tố gây bất hoạt, có nhiệt độ [4][30] 3.2.2 Khả ổn định với yếu tố nhiệt-ẩm Nhiệt ẩm yếu tố ảnh hưởng lớn tới độ ổn định chế phẩm sinh học Sự có mặt yếu tố làm tăng tác động yếu tố lại đến độ ổn định 40 protein [13] Trong thí nghiệm này, chúng tơi đánh giá hoạt tính cịn lại ACT ACT đông khô điều kiện lão hóa cấp tốc: nhiệt độ 40 ± 2oC hàm ẩm 75 ± 5% thời điểm khác nhau: ngày, ngày, tuần Kết ghi lại bảng 3.12: Bảng 3.12 Hàm ẩm hoạt tính alpha-chymotrypsin alpha-chymotrypsin đơng khơ điều kiện nhiệt độ 40oC, hàm ẩm 75% theo thời gian Alpha-chymotrypsin Hoạt tính Hoạt tính Hàm (đơn vị cịn lại ẩm (%) USP/mg) (%) 7,50 1694,00 100,00 7,41 1445,80 85,35 8,92 1069,85 64,14 11,65 969,08 59,89 Thời gian (ngày) 21 Alpha-chymotrypsin đơng khơ Hoạt tính Hoạt tính Hàm ẩm (đơn vị lại (%) USP/mg) (%) 0,85% 124,00 100,00 0,85% 130,43 102,23 3,24% 113,28 89,15 12,95% 93,26 85,66 Từ kết trên, xây dựng đường động học biểu diễn hoạt tính ACT ACT đơng khơ theo thời gian: 120% Hoạt ính cịn lại (%) 100% 80% 60% ACT ACT đơng khơ 40% 20% 0% 10 15 20 25 Thời gian (ngày) Hình 3.6 Hoạt tính cịn lại alpha-chymotrypsin alpha-chymotrypsin đông khô điều kiện nhiệt độ 40 ± 2oC, hàm ẩm 75 ± 5% theo thời gian  Nhận xét: Đồ thị biểu diễn động học trình gây hoạt tính enzym điều kiện lão hóa cấp tốc ACT ACT đơng khơ cho thấy ACT đơng khơ có xu hướng 41 trì độ ổn định tốt so với dạng ban đầu Có thể thấy rõ tốc độ mức độ hoạt tính dạng đơng khơ nhỏ Đáng ý ngày đầu tiên, ACT đông khô chưa bị hoạt tính ACT tới 14,65% hoạt tính Sau 21 ngày, BĐK trì mức hoạt tính cao 85,66% ACT cịn khoảng 60% hoạt tính Cơ chế tượng giải thích tương tự thí nghiệm 3.2.1: chênh lệch hàm ẩm khả ổn định cấu trúc phân tử liên kết với manitol liên kết với tá dược A, tá dược B làm tăng độ ổn định ACT đông khô so với ACT nguyên liệu [13][35] 3.2.2 Khả ổn định tác động lực học Đối với viên nén protein nói chung alpha chymotrypsin nói riêng, nguyên nhân gây hoạt tính khơng thể tránh khỏi tác động lực học trình dập viên Lực học trực tiếp gây biến dạng cấu trúc enzym đồng thời thời gian nén viên, lực học chuyển thành nhiệt gây biến tính enzym [28][29] Một mục tiêu để tăng độ ổn định viên nén giảm tối thiểu ảnh hưởng lực học tới cấu trúc enzym Do đó, thí nghiệm này, chúng tơi nghiên cứu khả ổn định học BĐK so với enzym ban đầu  Kết quả: Bảng 3.13 Hoạt tính cịn lại viên nén chứa alpha-chymotrypsin đông khô viên nén alpha-chymotrypsin sau dập Hoạt tính ban đầu (đơn vị USP/mg) ACT đơng khơ ACT Hoạt tính sau dập (đơn vị USP/mg) Hoạt tính cịn lại (%) 21,26 24,03 18,22 16,68 85,69 69,41  Nhận xét: Từ kết ta nhận thấy mức lực dập 1,5 Tons, ACT đơng khơ có khả trì hoạt tính enzym cao so với ACT Nguyên nhân tượng dạng đông khô alpha-chymotrypsin loại bỏ phân tử nước “liên kết” Điều làm cấu trúc alpha-chymotrypsin trở nên chặt chẽ chắn [18] giúp phân tử bị biến dạng tác động lực học 42 Ngoài ra, phân tử manitol liên kết bên phân tử enzym có vai trò khung đỡ cấu trúc, liên kết đa điểm tá dược A bề mặt phân tử có tác dụng khung chốt giúp trì cấu trúc enzym, giúp enzym giữ cấu trúc xoắn 𝛼 gấp β – dạng cấu trúc không gian enzym [12][35]  Kết luận chung: Từ thí nghiệm trên, chúng tơi nhận thấy rằng, ACT đơng khơ có khả ổn định hoạt tính enzym yếu tố gây biến tính dạng viên nén: yếu tố nhiệt (chu trình nhiệt lạnh), yếu tố nhiệt-ẩm lực học Do đó, chúng tơi sử dụng ACT đông khô thay cho dạng ban đầu để tiến hành nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu bào chế viên nén chứa bột đông khô alpha-chymotrypsin 3.3.1 Lựa chọn phương pháp bào chế Do tính nhạy cảm với lực, hàm ẩm chất hóa học ACT nên lựa chọn phương pháp dập thẳng để hạn chế yếu tố gây biến tính mà phương pháp dập khác gây Tuy nhiên, bột đơng khơ ACT chất xốp, khó trơn chảy nên chúng tơi tiến hành khảo sát độ trơn chảy trộn bột đông khô ACT với tá dược độn (Isomalt, tá dược C, Avicel, carrageenan) tá dược trơn chảy (magnesi stearat) Kết thu ghi lại bảng 3.14: Bảng 3.14 Góc nghỉ khối bột Loại bột Góc nghỉ BĐK 55,0o BĐK + tá dược C 36,0o BĐK + Isomalt 42,0o BĐK + Avicel 40,0o BĐK + Carrageenan 40,0o BĐK + tá dược C + 1% magnesi stearat + 2% aerosil 32,0o BĐK + Isomalt + 1% magnesi stearat + 2% aerosil 35,3o BĐK + Avicel + 1% magnesi sterat + 2% aerosil 37,0o BĐK + Carrageenan + 1% magnesi sterat + 2% aerosil 37,0o 43  Nhận xét: Bột đơng khơ ban đầu có khả trơn chảy kém, góc nghỉ 55oC Sau trộn với tá dược độn, khả trơn chảy khối bột thiện: góc nghỉ từ 36-42o Tuy nhiên, khả trơn chảy khối bột chưa thỏa mãn điều kiện phương pháp dập thẳng