BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG TÁ DƯỢC DISTEAROYL PHOSPHATIDYLGLYCEROL VÀ PHOSPHATIDYLCHOLIN ĐẬU NÀNH HYDROGEN HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG TÁ DƯỢC DISTEAROYL PHOSPHATIDYLGLYCEROL VÀ PHOSPHATIDYLCHOLIN ĐẬU NÀNH HYDROGEN HÓA Người hướng dẫn: TS. Trần thị Hải Yến Nơi thực hiện: Bộ môn bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Trần Thị Hải Yến Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ về những chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã động viên, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên: Mai Thị Thùy Linh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Amphotericin B 2 1.1.1. Nguồn gốc 2 1.1.2. Công thức hóa học 2 1.1.3. Đặc tính lý hóa 2 1.1.4. Tác dụng dược lý 3 1.1.5. Dược động học 3 1.1.6. Chỉ định 4 1.1.7. Tác dụng không mong muốn (thường gặp) 4 1.1.8. Liều dùng 4 1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 5 1.2. Liposome 5 1.2.1. Khái niệm 5 1.2.2. Thành phần của liposome amphotericin B 6 1.2.3. Ưu nhược điểm 8 1.2.4. Độ ổn định 10 1.3. Bào chế liposome 11 1.3.1. Bào chế liposome thô bằng phương pháp hydrat hóa film 11 1.3.2. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 11 1.3.3. Đông khô liposome 14 1.4. Một số nghiên cứu về liposome AMB 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu. 18 2.2. Nội dung nghiên cứu 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1. Phương pháp xác định độ tan của AMB trong methanol tại các pH khác nhau 19 2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB 20 2.3.3. Phương pháp làm giảm và đồng nhất KTTP liposome 22 2.3.4. Đông khô liposome 22 2.3.5. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome AMB. 23 2.4. Điều kiện thí nghiệm 26 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 27 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng AMB bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS 27 3.1.1. Quét phổ dung dịch chuẩn AMB trong methanol 27 3.1.2. Khảo sát độ đặc hiệu 27 3.1.3. Đường chuẩn biểu thị sự tương quan giữa nồng độ AMB trong methanol và mật độ quang 28 3.1.4. Khảo sát độ lặp lại 29 3.2. Khảo sát độ tan của AMB trong methanol ở các pH khác nhau. 30 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome AMB. 30 3.3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất trong công thức 30 3.3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid. 34 3.3.3. So sánh các phương pháp làm giảm KTTP liposome 35 3.3.4. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa đến các đặc tính của liposome 37 3.4. Nghiên cứu đông khô liposome 39 3.4.1. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô đến các đặc tính của liposome AMB. 39 3.4.2. Đông khô liposome 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT: 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/cụm từ đầy đủ 1 ABCD Amphotericin B colloidal dispersion 2 ABLC Amphotericin B lipid complex 3 AMB Amphotericin B 4 BHA Butylated hydroxyanisole 5 BHT Butylated hydroxytoluen 6 Chol Cholesterol 7 DC Dược chất 8 DĐVN Dược điển Việt Nam 9 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 10 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid 11 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography) 12 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogennated soy phosphatidylcholine) 13 KTTP Kích thước tiểu phân 14 L-AMB Liposome amphotericin B 15 NSX Nhà xản xuất 16 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 17 PTFE Polytetraflouroethylene 18 TKHH Tinh khiết hóa học 19 USP United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) 20 Z average Kích thước tiểu phân trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1. Độ tan của amphotericin B trong các dung môi khác nhau 3 Bảng 1.2. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 5 Bảng 2.1. Nguyên liệu 18 Bảng 3.1. Mật độ quang của các dung dịch chuẩn trong methanol 28 Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS 29 Bảng 3.3. Độ tan (mg/ml) của AMB trong methanol ở các pH khác nhau 30 Bảng 3.4. Thành phần các công thức bảo chế liposome AMB thay đổi tỉ lệ dược chất 31 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất đến các đặc tính của liposome AMB. 31 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất đến độ ổn định của liposome. 32 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid tới đặc tính của liposome 34 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của phương pháp làm nhỏ KTTP đến các đặc tính của liposome. 36 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của dung dịch dùng hydrat hóa đến pH của hỗn dịch liposome 37 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của dung dịch dùng hydrat hóa đến đặc tính của liposome. 38 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô tới đặc tính của liposome AMB. 40 Bảng 3.12. Các đặc tính của liposome sau khi phân tán trở lại từ mẫu đông khô. 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1. Cấu trúc của liposome 6 Hình 1.2. Cấu trúc liposome AMB 6 Hình 1.3. Phân tử HSPC và DSPG. 6 Hình 1.4. Thiết bị đùn ép mini extruder (a) và thiết bị đùn ép dưới áp suất cao (b). 14 Hình 1.5. Sơ đồ quá trình đông khô 15 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế liposome AMB bằng phương pháp hydrat hóa màng film. 21 Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-VIS của AMB 27 Hình 3.2. Đường chuẩn của amphotericin B trong methanol và phương trình hồi quy thực nghiệm 28 Hình 3.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất đến các đặc tính của liposome AMB. 32 Hình 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid đến đặc tính của liposome. 34 Hình 3.5. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa đến các đặc tính của liposome. 38 Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô tới đặc tính của liposome AMB. 40 Hình 3.7. Sản phẩm đông khô sử dụng tá dược lactose, sucrose, mannitol 42 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhiễm nấm là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong ở những bệnh nhân ung thư và các bệnh nhân suy giảm miễn dịch khác. Hiện nay, sử dụng đầu tay trong điều trị nhiễm nấm chủ yếu giới hạn trong hai nhóm thuốc: các thuốc kháng sinh polyene (amphotericin B, nystatin) và các imidazoles (ketaconazole, miconazole). Trong đó, Amphotericin B đã được sử dụng phổ biến trong điều trị được hơn 40 năm nay do phổ tác dụng rộng và ít bị kháng thuốc. Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là hầu như không tan trong nước nên sinh khả dụng thấp và nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là gây độc cho thận. Vì vậy, nghiên cứu một hệ mang thuốc giúp giảm độc tính trên thận và tăng hiệu quả điều trị của thuốc là vấn đề cấp thiết. Nhiều hệ mang thuốc chứa amphotericin B đã được nghiên cứu phát triển và ứng dụng trên thế giới như: vi nang, vi cầu, phức hợp lipid, liposome. Trong đó, hệ vận chuyển thuốc tiên tiến có nhiều ưu điểm nhất là dạng thuốc liposome do có thể làm tăng thời gian lưu thông của thuốc trong hệ tuần hoàn, tăng khả năng thấm nội bào, khu trú tác dụng của thuốc tại cơ quan đích Để góp phần ứng dụng liposome làm chất mang cho dược chất ít tan trong nước, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B sử dụng tá dược distearoyl phosphatidylglycerol và phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa” nhằm mục tiêu: + Bào chế được liposome amphotericin B sử dụng tá dược distearoyl phosphatidylglycerol và phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa bằng phương pháp hydrat hóa film. +Bước đầu đông khô liposome AMB và nghiên cứu ảnh hưởng của các tá dược đông khô đến đặc tính của liposome amphotericin B sau pha lại. [...]... dài Vì vậy, b o < /b> chế < /b> liposome < /b> ở dạng b t đông khô là hướng đi mới để kéo dài tuổi thọ của chế < /b> phẩm [33] 1.3 B o < /b> chế < /b> liposome < /b> 1.3.1 B o < /b> chế < /b> liposome < /b> thô b ng phương pháp hydrat hóa film Phương pháp này được Bangham đưa ra và phát triển từ năm 1965 và cho đến nay vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để b o < /b> chế < /b> liposome < /b> vì tính tiện ích, dễ thực hiện, không yêu cầu thiết b công nghệ cao, dễ b sung cải... trúc liposome < /b> AMB 1.2.2 Thành phần của liposome < /b> amphotericin < /b> B 1.2.2.1 Vỏ liposome < /b> Vỏ liposome < /b> gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol Phospholipid Phospholipid sử dụng trong liposome < /b> AMB bao gồm phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC) và distearoylphosphatidylglycerol (DSPG) Hình 1.3 Phân tử HSPC và DSPG HSPC có các ưu điểm sau: b n về hóa học hơn so với phosphatidylcholin đậu nành. .. glycerol còn được biết đến như những chất b o vệ cấu trúc thường được sử dụng trong đông khô, giúp duy trì sự đồng nhất của hỗn dịch Cụ thể, nếu sử dụng kết hợp một lượng nhỏ glycerol và carbohydrat có sự đồng nhất cao hơn (PDI về liposome < /b> AMB Profitt cùng cộng sự đã nghien cứu < /b> b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB từ các tá dược HSPC, DSPG,... tích mẫu có thể b o < /b> chế < /b> b ng phương pháp này thường hạn chế < /b> do quy mô của b dụng cụ nhỏ [21] 14 a, b, Hình 1.4 Thiết b đùn ép mini extruder (a) và thiết b đùn ép dưới áp suất cao (b) b, Đùn ép dưới áp suất cao Với thiết b có quy mô lớn hơn, liposome < /b> có thể được nén qua màng với áp suất cao hơn, sử dụng khí nén là Nitơ Liposome < /b> sẽ b b c tứng lớp một” cho đến kích thước mong muốn Khi b nén qua lỗ... soát các dược chất: Khi dược chất được nang hóa trong liposome,< /b> cấu trúc đặc biệt của liposome < /b> làm giảm lượng dược chất b chuyển hóa khi qua gan và lượng lớn dược chất còn lại vượt qua được các quá trình chuyển hóa này sẽ tạo hiệu quả tác dụng cao hơn [13], [22], [35] - Giảm độc tính của thuốc, ví dụ như: ở dạng b o < /b> chế < /b> liposome,< /b> AMB liên kết b n chặt với lớp màng lipid do tạo thành phức hợp AMB – chol,... cholesteryl, phức 4 amphotericin < /b> B lipid hoặc liposome < /b> amphotericin < /b> B - Hấp thu: Amphotericin < /b> B không hấp thu được qua đường tiêu hóa và phải được dùng đường tiêm - Phân b : hơn 90 % thuốc gắn kết với protein huyết tương, chủ yếu là lipoprotein Thông tin về phân b của amphotericin < /b> B còn hạn chế < /b> Để đạt được nồng độ trong dịch não tủy có tác dụng kìm nấm, amphotericin < /b> B phải được thường xuyên tiêm vào trong vỏ... trong liposome < /b> AMB, cholesterol có ái lực tốt với AMB nên tạo liên kết với AMB góp phần đưa dược chất vào pha dầu của cấu trúc liposome,< /b> giúp ổn định cấu trúc này, hạn chế < /b> rò rỉ dược chất và giúp liposome < /b> vận chuyển AMB tới đích tác dụng Chỉ khi nào tiếp xúc với sterol của tế b o < /b> nấm là ergosterol thì AMB trong liposome < /b> mới được giải phóng do có ái lực cao hơn với sterol này [26],[28] 1.2.2.2 Dược chất... phép lọc loại khuẩn liposome < /b> và sử dụng liposome < /b> b ng đường tiêm tĩnh mạch [31] Liposome < /b> được làm giảm KTTP b i các tác dụng của lực cắt Các phương pháp được sử dụng để làm giảm kích thước của liposome < /b> là dùng siêu âm hoặc đồng nhất, hoặc b ng cách đóng b ng và tan b ng, thẩm tách một dung dịch có chứa chất 12 tẩy rửa từ lipids, hoặc các phương pháp khác Kích thước của các hạt liposome,< /b> cho dù chúng là... tiền nên giá thành chế < /b> phẩm cao [2],[13] - Đa số các phương pháp b o < /b> chế < /b> liposome < /b> đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động b t lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [36] - Đa số các phương pháp b o < /b> chế < /b> liposome < /b> chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [29] 1.2.4 Độ ổn định Một trong những lý do làm cho liposome < /b> chưa được đưa vào sản xuất hàng... 1.1.4 Tác dụng dược lý Amphotericin < /b> B là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là ergosterol) ở màng tế b o < /b> nấm làm biến đổi tính thấm của màng [4],[20] Amphotericin < /b> B cũng gắn với sterol b o < /b> chất của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được một phần độc tính của thuốc đối với người [4] Trên mặt lâm sàng, amphotericin < /b> B có thể chống lại Absidia spp , Aspergillus spp , Basidiobolus . amphotericin B sử dụng tá dược distearoyl phosphatidylglycerol và phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa nhằm mục tiêu: + B o chế được liposome amphotericin B sử dụng tá dược distearoyl phosphatidylglycerol. B Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU B O CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG TÁ DƯỢC DISTEAROYL PHOSPHATIDYLGLYCEROL VÀ PHOSPHATIDYLCHOLIN ĐẬU NÀNH HYDROGEN. HYDROGEN HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 B Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THÙY LINH NGHIÊN CỨU B O CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG TÁ DƯỢC DISTEAROYL