Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh. Năm 1997, GS. TS. Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam. Thành phần hóa học chính của Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường 2, 5. Các đặc tính dược lý của Giảo cổ lam hầu hết đều thuộc về saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc 36. GCL được biết đến với rất nhiều tác dụng quý như tác dụng hạ lipid 20, 39, hạ đường huyết 36, ức chế khối u 21, 36, tác dụng tốt trên tim mạch và hệ thần kinh 12, 36…Do vậy, GCL hỗ trợ tốt trong các trường hợp mỡ máu cao, huyết áp cao, đái tháo đường tuýp II… Tuy nhiên, nguồn gốc và thành phần hóa học của GCL khá phức tạp. Saponin trong GCL khác nhau giữa các loài và vùng trồng, thay đổi theo điều kiện thời tiết khí hậu 18. Hơn nữa, hiện chưa xác định được saponin có tác dụng dược lý đặc trưng do vậy việc kiểm soát chất lượng của dược liệu gặp nhiều khó khăn. Các loại kỹ thuật dấu vân tay Fingerprint đã dần dần đi vào thực tế bằng việc xây dựng mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các đặc tính hóa học của thảo dược. Phương pháp này góp phần xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn định, giúp kiểm soát chất lượng thảo dược và các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược. Đây là một xu hướng trong định tính dược liệu và các chế phẩm đông dược. Nhằm hoàn thiện tiêu chuẩn dược liệu Giảo cổ lam, giúp lựa chọn nguồn nguyên liệu ổn định và chất lượng, khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC” đươc thực hiện với 2 mục tiêu sau:
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THANH NGA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HẠT VẢI (SEMEN LITCHI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ THANH NGA NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA HẠT VẢI (SEMEN LITCHI) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS.Nguyễn Mạnh Tuyển 2. DS. Phạm Thị Anh Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền Hà Nội - 2013 LỜI CẢM ƠN Vi tt c tm lòng, em xin gi li cc ti PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển. Thng dn, ch bo, h tr v mi mt trong quá trình thc hin khóa lun. Em xin chân thành cDS. Phạm Thị Anh ng dn t nhng kinh nghi khóa luc hoàn thi Em xin chân thành cthầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược học cổ truyền, trường đại học Dược Hà Nội u ki trong sut thi gian thc hin khóa lun. Xin c i các anh chị khoa Hóa phân tích, Dược lý- Viện Dược Liệu em rt nhiu trong thi gian qua. ch Hà N Sinh viên H Thanh Nga MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2 1.1. THỰC VẬT HỌC 2 1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.1.1. Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae) 2 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn 3 1.1.1.3. Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn 3 1.1.2. Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn 3 1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 4 1.2.1. Thành phần hóa học 4 1.2.2. Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền 4 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY 5 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5 1.3.1.1. Thành phần hóa học 5 1.3.1.2. Tác dụng sinh học 6 1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7 1.4.1.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết 7 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9 2.1. NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 9 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu 9 2.1.2. Trang thiết bị 9 2.1.3. Hóa chất, dung môi 10 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm vi học 10 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học 10 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 11 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.3.1.Chuẩn bị mẫu 11 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học 11 2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học 11 2.3.3.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải 11 2.3.3.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt vải 12 2.3.4. Nghiên cứu tác dụng sinh học 14 2.3.4.1. Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH 14 2.3.4.2. Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid 15 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 17 3.1. NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI HỌC 17 3.2. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 18 3.2.1. Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải 18 3.2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải 25 3.2.2.1. Xác định độ ẩm 25 3.2.2.2. Chiết xuất 25 3.2.2.3. Định lƣợng các phân đoạn bằng phƣơng pháp cân 26 3.2.2.4. Định tính các phân đoạn 27 3.3. NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC 32 3.3.1. Chuẩn bị cao ethanol toàn phần 32 3.3.2.Thử nghiệm dọn gốc DPPH 32 3.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 32 3.3.2.2. Chuẩn bị dung dịch DPPH 32 3.3.2.3. Tiến hành 32 3.3.3. Thử nghiệm dọn gốc superoxid 34 3.3.3.1. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 34 3.3.3.3. Tiến hành 34 3.4. BÀN LUẬN 36 3.4.1. Đặc điểm vi học 36 3.4.2. Thành phần hóa học 36 3.4.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BuOH n- butanol DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EtOAC etyl acetat EtOH ethanol IC 50 The half maximal inhibitory concentration NADH Nicotinamide adenine dinucleotide NBT Nitroblue tetrazolium PMS Phenazine methosufate DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Kết quả định tính hạt Vải bằng phản ứng hóa học 24 Bảng 3.2. Kết quả xác định độ ẩm hạt Vải 25 Bảng 3.3. Kết quả định lƣợng các phân đoạn 27 Bảng 3.4. Kết quả định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học 28 Bảng 3.5. Bảng giá trị R f của các vết ở phân đoạn n-hexan 30 Bảng 3.6. Bảng giá trị R f tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn ethyl acetat 31 Bảng 3.7. Bảng giá trị R f tƣơng ứng của các vết ở phân đoạn n-butanol 32 Bảng 3.8. Hỗn hợp phản ứng 33 Bảng 3.9. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải, quercetin 33 Bảng 3.10. Hỗn hợp phản ứng 35 Bảng 3.11. Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do superoxid của dịch chiết hạt Vải và superoxid dismutase 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới 4 Hình 2.1. Hình ảnh hạt Vải 9 Hình 3.1. Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt Vải dƣới kính hiển vi 17 Hình 3.2. Tinh thể hình kim 21 Hình 3.3.Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết hạt Vải 26 Hình 3.4. Sắc ký đồ của phân đoạn n-hexan 29 Hình 3.5. Sắc ký đồ của phân đoạn ethyl acetat 30 Hình 3.6. Sắc ký đồ của phân đoạn n-butanol 31 Hình 3.7. Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải và quercetin 34 Hình 3.8: Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do superoxid của dịch chiết hạt vải (A) và superoxid dismutase (B) 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Bên cạnh đó Việt Nam còn được thừa hưởng một nền y học cổ truyền phát triển từ rất lâu đời. Vì vậy, nguồn dược liệu dồi dào cùng với vốn kinh nghiệm sử dụng của các dân tộc chính là một nguồn nguyên liệu vô cùng quý giá cho các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên, cũng như những nghiên cứu về hoạt tính sinh học theo hướng hiện đại. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong hệ thống sinh học [23]. Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây ra các bệnh: ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, các bệnh thoái hóa thần kinh, viêm khớp dạng thấp, lão hóa [25], [32], [43]. Chính vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện các chất có khả năng phân hủy, loại bỏ các gốc tự do, chúng được gọi là các chất chống oxy hóa như: các enzym (superoxid dismutase, glutathione peroxidase, catalase…), acid ascorbic, α-tocopherol, glutathione, carotenoid, flavonid,… Theo hướng nghiên cứu đó, hiện nay đã có nhiều công bố về tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết [39], [41] của dược liệu hạt Vải (Semen Litchi). Trong y học cổ truyền Việt Nam, hạt Vải đã được sử dụng để điều trị nhiều chứng bệnh như: chữa đau dạ dày, chữa răng sưng đau có sâu…Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu về dược liệu hạt Vải ở Việt Nam còn hạn chế. Để góp phần tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc của Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt Vải ( Semen Litchi ) với 2 mục tiêu: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học hạt Vải (Semen Litchi) 2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết toàn phần hạt Vải trên in vitro. [...]... chuẩn tinh khiết phân tích 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học Nghiên cứu đặc điểm bột hạt Vải 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học Định tính xác định các nhóm hợp chất trong hạt Vải Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải 11 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của dịch chiết toàn phần hạt Vải với 2 thử nghiệm: - Thử nghiệm dọn gốc... bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học Hạt Vải (lệ chi hạch) chứa tanin, chất béo, saponosid, α- metylen cyclopropyglycin [8], [12], [14] 1.2.2 Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền Theo y học cổ truyền, hạt Vải có vị ngọt chát, tính ôn, quy kinh can thận, có tác dụng ôn trung lý khí, chỉ thống [8], [12], [14] Công dụng chữa... PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1.Chuẩn bị mẫu Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu đặc điểm vi học Hạt Vải sấy ở 600C, để nguội, tán nhỏ bằng thuyền tán, rây qua rây số 125, phần trên rây được tán nhỏ và rây tiếp, lặp lại vài lần cho đến khi toàn bộ dược liệu thành bột mịn [4] Bột mịn được cho vào lọ, dán nhãn dùng để soi bột Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học Hạt Vải sấy... có tác dụng chống oxy hóa ở mức độ trung bình [30] 7 Một nghiên cứu khác thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH, ức chế lipid peroxydation, đối với các dịch chiết hạt Vải: ethanol 90%, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [27] Tác dụng chống ung thư Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, ... glycine, sau đó thử tác dụng trên chuột thấy có tác dụng hạ đường huyết, giảm nồng độ glycogen ở gan [19] Tác dụng ức chế tyrosinase Thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên in vitro đối với các dịch chiết từ hạt Vải: ethanol, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh nhất [27] 1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 1.4.1.1 Tác dụng hạ đường huyết... protocatechui acid [30] 6 Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt vải, đã phân lập 5 hợp chất phenolic: gallic acid, procyanidin B2, α-gallocatechin , α-epicatechin, α-epicatechin-3-gallate [27] 1.3.1.2 Tác dụng sinh học Tác dụng chống oxy hóa Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được một số anthocyanidin, sau đó thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH, TEAC... lần, mỗi lần 8g Bài 3: Bài thuốc chữa đau dạ dày [14] Hạt vải 3g Mộc hương 2g Nghiền thành bột Cách dùng: Uống với nước, ngày 3 thang Bài 4: Bài thuốc chữa răng sưng đau có sâu [8] Hạt vải sấy khô, tán bột, xát vào răng bị đau nhiều lần trong ngày 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 1.3.1.1 Thành phần hóa học Từ dịch chiết ethanol 95%, đã phân lập 7 flavonoid... 50% của hạt Vải, thử tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết bằng alloxan ở chuột nhắt trắng với liều uống 1,5g và 3g 8 cao/ kg thể trọng/ ngày (tương đương với 10g và 20g dược liệu khô), trong 8 ngày liên tục, tác dụng hạ đường huyết ở liều 1,5g cao/ kg thể trọng/ ngày có tác dụng mạnh hơn [10] 9 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT... kính hiển vi: + Quan sát mô tả đặc điểm điển hình (vỏ hạt, phôi, nội nhũ,…) + Chọn chất lỏng lên tiêu bản nhằm làm cho đối tượng nghiên cứu trở nên sáng hơn, rõ hơn [4], [13] 2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.3.1 Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải a Nguyên tắc 12 Chiết xuất: Sử dụng các quy trình chiết chuyên biệt dựa vào độ tan của các chất trong dung môi khác nhau để loại bỏ các... nm và 366nm, sau đo dùng thuốc thử hiện màu 2.3.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học 2.3.4.1 Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH Phương pháp được thực hiện theo Blois (1958) [36] Nguyên tắc của phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dược liệu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của . học và tác dụng sinh học của hạt Vải ( Semen Litchi ) với 2 mục tiêu: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học hạt Vải (Semen Litchi) 2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết toàn phần hạt Vải. thành phần hóa học 10 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 11 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.3.1.Chuẩn bị mẫu 11 2.3.2. Nghiên cứu đặc điểm vi học 11 2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học 11. 1.2.1. Thành phần hóa học 4 1.2.2. Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền 4 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY 5 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5 1.3.1.1. Thành phần hóa học