LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, ThS. Vũ Vân Anh – những người thầy đã trực tiếp dạy dỗ và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật vì đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo và cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong 5 năm học tại trường. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè tôi, gia đình tôi - những người luôn bên cạnh tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Vũ Lê Thu BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ LÊ THU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ LÊ THU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa 2. Th.S Vũ Vân Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, ThS. Vũ Vân Anh – những người thầy đã trực tiếp dạy dỗ và tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật vì đã luôn quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn toàn thể các thầy cô giáo và cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, dìu dắt tôi trong 5 năm học tại trường. Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tôi, bạn bè tôi - những người luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Vũ Lê Thu MỤC LỤC Trang Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Đặt vấn đề………………………………………………………………………… 1 Phần 1 - Tổng quan……………………………………………………………… 3 1.1. Đặc điểm thực vật và phân loại chi Spilanthes………………………………3 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Spilanthes……………………………………… 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Spilanthes và một số loài thuộc chi này……………………………………………………………………….3 1.2. Thành phần hóa học của cây Nút áo………………………………………….5 1.3. Tác dụng sinh học, công dụng của cây Nút áo……………………………….8 1.3.1. Tác dụng sinh học của cây Nút áo…………………………………… 8 1.3.2. Công dụng, cách sử dụng của cây Nút áo………………………………… 8 1.4. Một số vi khuẩn gây sâu răng……………………………………………… 10 Phần 2 – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu………………………………….12 2.1. Đối tượng nghiên cứu…………………………………………………………12 2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu…………………………………………………… 12 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu…………………………………………………… 13 2.2. Nội dung nghiên cứu…….……………………………………………………13 2.2.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật………………………………………………13 2.2.2. Thử hoạt tính sinh học …………………………………………………… 14 2.2.3 Định tính các thành phần hóa học và phân lập một số thành phần hóa học trong mẫu cây Nút áo có hoạt tính……………………………………………14 2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………………… 14 2.3.1. Nghiên cứu về thực vật………………….………………………………… 14 2.3.2. Thử hoạt tính sinh học bộ phận trên mặt đất cây Nút ……… …………….15 2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học ………………… 18 Phần 3 – Thực nghiệm, kết quả và bàn luận…………………….……………… 20 3.1. Kết quả thực nghiệm…………………………………………………………20 3.1.1. Nghiên cứu về thực vật…………………………………………… 20 3.1.2. Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết các phần trên mặt đất…………… 28 3.1.3. Nghiên cứu thành phần hóa học………………………………………… 32 3.2. Bàn luận ……………………………………………………… 45 3.2.1. Bàn luận về phương pháp nghiên cứu….……………………… 45 3.2.2. Bàn luận về kết quả nghiên cứu………………………………………… 46 Kết luận và kiến nghị……….…………………………………………………….50 Tài liệu tham khảo Phụ lục Phụ lục 1: Hình ảnh một số loài thuộc chi Spilanthes Phụ lục 2: Sắc kí khí khối phổ tinh dầu Nút áo Phụ lục 3: Đường kính vòng vô khuẩn các mẫu thử Phụ lục 4: Hình ảnh peak SKLM các phân đoạn M, A, B, C Phụ lục 5: Phổ NMR của A20.4.6. Phụ lục 6: Bảng so sánh sắc kí NMR của A20.4.6 và β-sitosterol Phụ lục 7: Phiếu giám định tên khoa học và giấy chứng nhận mã số tiêu bản DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ATCC American Type Culture Collection DM Dung môi CC Column Chromagraphy GC-MS Gas chromatography–mass spectrometry HPTLC High performance thin layer chromatography L. Carl Linnaeus MBC Minimum Bactericidal Concentration. MIC Minimum Inhibitory Concentration NCTC National Collection of Type Cultures NMR Nuclear magnetic resonance S. Spilanthes sp. species SKLM Sắc kí lớp mỏng TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử VSV Vi sinh vật UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng số Tên bảng Trang 1.1 Các chất chuyển hóa thứ cấp trong chi Spilanthes 7 2.1 Bảng kí hiệu các mẫu thực nghiệm 12 3.1 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn các mẫu thử 28 3.2 Đường kính trung bình vòng vô khuẩn mẫu thử và Gentamycin 31 3.3 Kết quả định tính các nhóm chất trong cụm hoa Nút áo 32 3.4 Hàm lượng các thành phần trong tinh dầu hoa Nút áo 33 3.5 Kết quả định tính các cắn A, B, C bằng phản ứng hóa học 36 3.6 Số peak sắc kí SKLM từng phân đoạn M, A, B, C 37 3.7 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 20.4.6 43 3.8 Bảng so sánh đặc điểm hình thái các mẫu nghiên cứu 46 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình số Tên hình Trang 1.1 Spilanthol 6 1.2 Stigmasterol 6 2.1 Sơ đồ quy trình thử hoạt tính kháng vi sinh vật 17 3.1 Ảnh hình thái các mẫu Nút áo 22 3.2 Ảnh hình thái lá các mẫu Nút áo 22 3.3 Hình vẽ hình thái các mẫu Nút áo 22 3.4 Hình thái cụm hoa các mẫu Nút áo 23 3.5 Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp1 (V) chụp qua kính lúp soi nổi 23 3.6 Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp2 (L) chụp qua kính lúp soi nổi 24 3.7 Ảnh hình thái hoa Spilanthes sp3 (T) chụp qua kính lúp soi nổi 24 3.8 Hình ảnh vi phẫu rễ Nút áo 27 3.9 Hình ảnh vi phẫu thân Nút áo 27 3.10 Hình ảnh vi phẫu lá Nút áo 28 3.11 Hình ảnh các mẫu có hoạt tính 30 3.12 Hình ảnh đĩa thạch thử VH và Gentamycin 31 3.13 Đường đáp ứng của Gentamycin với Streptococcus mutans 31 3.14 Sơ đồ chiết xuất và chiết phân đoạn 34 3.15 Hình ảnh SKLM cắn M và các phân đoạn A,B,C trong hệ 37 dung môi CHCl 3 – MeOH (9:1) 3.16 Hình ảnh SKLM các phân đoạn gộp lần 1 với hệ dung môi n-Hexan – EtOAc (3:1) 40 3.17 Hình ảnh SKLM các phân đoạn gộp lần 2 với hệ dung môi n-Hexan - EtOAc (3:1) 40 3.18 Hình ảnh SKLM phân đoạn A20.4.6 41 3.19 Cấu trúc hóa học của hợp chất 20.4.6 42 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Họ Cúc (Asteraceae) được xem như là họ lớn nhất trong ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) với 1620 chi và 23600 loài phân bố ở khắp nơi trên thế giới(theo dữ liệu của Vườn thực vật Hoàng gia Kew)[19]. Với đặc điểm đa dạng về loài và phân bố như vậy, họ Cúc có ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực và đem lại giá trị thương mại cao. Nút áo (hay còn gọi là Cúc áo, Nụ áo, Cỏ the, Cuống trầm…[7] [8]) là tên gọi chung một số loài thuộc chi Spilanthes của họ Cúc. Cây Nút áo từ lâu đã được các thầy lang, các nhà khoa học, thực vật học nghiên cứu rất nhiều và cho thấy tác dụng hiệu quả trong điều trị nhiều bệnh như: đau răng, viêm miệng, đau họng, bại lưỡi, sốt rét, viêm phế quản, hen suyễn, các bệnh ngoài da, phong thấp, đau xương, bệnh scorbut…Tuy nhiên, công dụng phổ biến nhất của cây Nút áo là chữa đau nhức răng, sâu răng bằng các giã nhỏ, ngâm rượu để ngậm hoặc đặt trực tiếp vào chỗ răng đau [13].Với nhiều tác dụng như vậy, Nút áo được xem là một dược liệu rất đáng để khai thác, đặc biệt là hướng đến việc điều trị các bệnh liên quan tới nhiễm khuẩn răng miệng. Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu về cây Nút áo đã được tiến hành rất nhiều. Tuy nhiên, về thực vật, trong khi số lượng loài trong chi Spilanthes khá lớn và phân bố hầu như rộng khắp trong cả nước nhưng vẫn chưa có nghiên cứu nào thực hiện việc so sánh đặc điểm hình thái của các loài để tránh nhầm lẫn khi giám định tên khoa học các loài đó. Ở Việt Nam, các đề tài nghiên cứu về hóa học, thực vật cũng như hoạt tính sinh học của cây Nút áo còn hạn chế. Những đề tài nghiên cứu về mặt hóa học chủ yếu dừng lại ở việc định tính các nhóm hợp chất trong hoa Nút áo. Còn về mặt nghiên cứu tác dụng sinh học của cây thì hoàn toàn chưa được thực hiện. Xuất phát từ những lí do trên, nhằm tìm hiểu sâu hơn về nguồn gốc và đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Nút áo, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Nút áo” với các mục tiêu sau: [...]... 1 Mô tả đặc điểm thực vật của các mẫu cây Nút áo, giám định được tên khoa học của các mẫu này 2 Nghiên cứu thành phần hóa học của cụm hoa cây Nút áo 3 Đánh giá hoạt tính sinh học của cây Nút áo bằng việc xác định mức độ ức chế vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans của dịch chiết phần trên mặt đất, so sánh hoạt tính sinh học của dịch chiết với Gentamycin 3 PHẦN 1TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT... N-(2-phenelethyl)-2E, 6Z, 8Edecatrienamide [52] 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC, CÔNG DỤNG CỦA CÂY NÚT ÁO 1.3.1 Tác dụng sinh học của cây Nút áo - Dịch chiết cây Nút áo có tác dụng ức chế và gây độc cho ấu trùng Plutella xylostera – là sâu tơ phá hoại rau màu Ngoài ra, Spilanthol có trong hoa Nút áo được xem là chất có hoạt tính sinh học mạnh nhất [16] - Dịch chiết cồn của Spilanthes oleracea thể hiện hoạt tính mạnh... học (V, L) - Thử tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus mutans của các dịch chiết mẫu nghiên cứu trên Lựa chọn mẫu cây có hoạt tính cao để nghiên cứu thành phần hóa học 2.2.3 Định tính các thành phần hóa học và phân lập một các thành phần hóa học trong mẫu cây Nút áo có hoạt tính - Định tính các thành phần trong dịch chiết cụm hoa Nút áo mẫu V - Chiết xuất tinh dầu trong cụm hoa và sử dụng phương pháp... 3.1.1.3 Đặc điểm vi phẫu cơ quan sinh dƣỡng các mẫu nghiên cứu Nhìn chung, các bộ phận rễ, thân và lá của 3 mẫu nghiên cứu có nhiều đặc điểm tương đồng Một số bộ phận có các đặc điểm phân biệt với nhau giữa các mẫu nghiên cứu Đặc điểm vi học được mô tả như sau: a Vi phẫu rễ Quan sát vi phẫu rễ 3 mẫu nghiên cứu, nhận thấy cấu tạo mặt cắt ngang của rễ cây là hình tròn, từ ngoài vào trong có các đặc điểm. .. chất phân lập được bằng các phương pháp đo phổ MS, NMR 20 PHẦN 3THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1.1 NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT 3.1.1.1 Đặc điểm thực vật các mẫu nghiên cứu Thực hiện nghiên cứu đặc điểm thực vật của cả 3 mẫu thu hái được (hình 3.1, 3.5) Từng mẫu được mô tả như sau: a Đặc điểm thực vật mẫu Spilanthes sp 1 (V) Cây cỏ, sống hàng năm, cao khoảng 20-50cm Thân nằm, rồi... Từ điển thực vật thông dụng [6], Từ điển cây thuốc [9], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [13]… để xác định tên khoa học - Tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu các cơ quan dinh dưỡng của cây: làm tiêu bản vi học [2], quan sát đặc điểm cấu tạo vi phẫu trên kính hiển vi, chụp ảnh và mô tả đặc điểm 15 2.3.3 Thử hoạt tính sinh học dịch chiết bộ phận trên mặt đất cây Nút áo  Mẫu vật: phần trên... Silicagel GF254 của hãng Merck (Đức) - Cột sắc kí - Bộ dụng cụ cất tinh dầu - Ống nghiệm, đĩa petri, pipet… 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật - Mô tả đặc điểm hình thái các bộ phận sinh sản và sinh dưỡng của các mẫu thu hái được 14 - So sánh đặc điểm hình thái giữa các mẫu thu hái được với đặc điểm trong khóa phân loại [14] và các tài liệu chính thống khác như Cây cỏ Việt Nam... để xác định thành phần của tinh dầu - Chiết phân đoạn dịch chiết cồn và sử dụng sắc kí cột để phân lập các thành phần; đo phổ NMR để xác định cấu trúc hóa học của thành phần đó 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nghiên cứu về thực vật - Phương pháp: mô tả phân tích và so sánh hình thái - Tài liệu khóa phân loại trong Thực vật chí Việt Nam [14] và các tài liệu chuyên sâu về thực vật như: Cây cỏ Việt Nam... Từ điển thực vật thông dụng [6], Từ điển cây thuốc [9], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [13] Từ đó giám định tên khoa học các mẫu thu hái được - Làm vi phẫu rễ, thân, lá, mô tả đặc điểm giải phẫu của mẫu nghiên cứu 2.2.2 Thử hoạt tính sinh học - Mẫu tươi các bộ phận trên mặt đất của 2 mẫu cây Nút áo mọc phổ biến được thu hái tại huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa để thử hoạt tính sinh học (V,... ta gặp tại Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng và Lạng Sơn [6] Cây mọc trên các trảng cây bụi và ven rừng thưa, ở độ cao từ 300 đến 1300 m [6] 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY NÚT ÁO Theo các tài liệu cho thấy thành phần hóa học trong cây Nút áo (Spilanthes spp.) bao gồm các chất sau: Spilanten (trong tinh dầu từ cụm hoa cũng như toàn cây) [7], [9] Spilanthol hay N-isobutyl-2E, 6Z, 8E-decatrienamide . 1.2. Thành phần hóa học của cây Nút áo ……………………………………….5 1.3. Tác dụng sinh học, công dụng của cây Nút áo …………………………….8 1.3.1. Tác dụng sinh học của cây Nút áo ………………………………… 8 1.3.2. Công dụng, . tiến hành đề tài Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Nút áo với các mục tiêu sau: 2 1. Mô tả đặc điểm thực vật của các mẫu cây Nút áo, giám định. N-(2-phenelethyl)-2E, 6Z, 8E- decatrienamide [52] 1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC, CÔNG DỤNG CỦA CÂY NÚT ÁO 1.3.1. Tác dụng sinh học của cây Nút áo - Dịch chiết cây Nút áo có tác dụng ức chế và gây độc cho ấu trùng Plutella