BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ LAN ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện Bộ môn Dược Liệu Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI -2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ LAN ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG GIẢO CỔ LAM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn ThS. Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh, người thầy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức cũng như những kinh nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu. Tôi cũng xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới sự giúp đỡ của ThS. Lê Thanh Bình, người đã cho tôi sự hỗ trợ kịp thời trong quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đang công tác tại bộ môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận đúng hạn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè tôi, những người đã luôn tin tưởng, cổ vũ, động viên tôi trong học tập và trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Phạm Thị Lan MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. TỔNG QUAN VỀ GIẢO CỔ LAM 2 1.1.1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume 2 1.1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume 2 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume 2 1.1.1.3. Các loài trong chi Gynostemma Blume tại Việt Nam 3 1.1.2. Thành phần hóa học của các loài Giảo cổ lam 5 1.1.2.1. Saponin trong Giảo cổ lam 5 1.1.2.2. Nghiên cứu về flavonoid 10 1.1.2.3. Các chất khác 11 1.2. TỔNG QUAN VỀ HỆ THỐNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO, CAMAG REPROSTAR 3, LINOMAT 5.0 12 1.3.1. Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer chromatography: HPTLC) 12 1.3.2.Camag Reprostar 3 138 1.3.3.Linomat 5.0 14 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên liệu 16 2.2. Phương tiện nghiên cứu 16 2.2.1. Thuốc thử, dung môi, chất chuẩn, dịch chiết so sánh 16 2.2.2. Máy móc, thiết bị, dụng cụ 17 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 18 2.3.2. Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng 193 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Thực nghiệm và kết quả 21 3.1.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 21 3.1.1.1.Chuẩn bị dịch chiết 21 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký 21 3.1.2. Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam 24 3.1.2.1. Định tính các mẫu thuộc loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 24 3.1.2.2. Định tính các loài Giảo cổ lam Việt Nam 303 3.2. Bàn Luận 3539 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 404 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BuOH Buthanol EtOH Ethanol G Gynostemma GCL Giảo cổ lam NXB Nhà xuất bản SKLM Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1. Cấu trúc Dammaran thuộc nhóm Saponin triterpen tetracyclic 5 2 Hình 1.2. Khung cấu trúc saponin trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 6 3 Hình 1.3. Cấu trúc epoxy dammaran từ G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 8 4 Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Gylongosid A 9 5 Hình 1.5. Công thức cấu tạo của Gylongosid B 9 6 Hình 1.6 Công thức cấu tạo của vinagynostesid A 10 7 Hình 1.7. Camag reprostar 3 13 8 Hình 1.8. Linomat 5.0 15 9 Hình 2.1. Sơ đồ quá trình chiết bằng n – BuOH bão hòa nước 18 10 Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino trong n – BuOH bão hòa nước, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366 nm và phun hai loại thuốc thử hiện màu 22 11 Hình 3.2. Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở Đắc Nông trong n – BuOH bão hòa nước với các thể tích chấm lần lượt từ 1µl đến 5µl sau khi khai triển với hệ dung môi (I), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại và phun thuốc thử hiện màu 23 12 Hình 3.3. Hình ảnhsắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu thuộc loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 25 13 Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino khi quan sát ở ánh sáng tử ngoạibước sóng 366 nm 27 14 Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết 13 mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi phun thuốc thử hiện màu 28 15 Hình 3.6. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 31 16 Hình 3.7. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume Việt Nam khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm 32 17 Hình 3.8. Hình ảnh sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric 33 DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1. Saponin thường gặp trong G. pentaphyllum (Thunb.) Makino 7 2 Bảng 1.2. So sánh giữa HPTLC và TLC 12 3 Bảng 3.1. Giá trị R f của các vết quan sát được trên sắc ký đồ của các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 25 4 Bảng 3.2. Giá trị R f và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của các mẫu G. pentaphyllum (Thunb.) Makino sau khi hiện màu 28 5 Bảng 3.3. Giá trị R f của các vết trên sắc ký đồ của dịch chiết một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume khi quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 31 6 Bảng 3.4. Giá trị R f và màu sắc của các vết trên sắc ký đồ của một số loài Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma Blume sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin – acid sulfuric 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh. Năm 1997, GS. TS. Phạm Thanh Kì đã phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam. Trong những năm gần đây, Giảo cổ lam được trồng trên diện rộng ở các địa phương, được chế biến thành các sản phẩm chè Giảo cổ lam đa dạng và được lưu thông rộng rãi trên thị trường như Giảo cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ lam Tam Đảo… Do nguồn gốc Giảo cổ lam phức tạp, không rõ ràng lại được sử dụng với số lượng lớn nên rất khó kiểm soát dẫn đến tình trạng dược liệu giả mạo, dược liệu kém chất lượng vẫn lưu thông tự do trên thị trường ảnh hưởng đến sức khỏe của nhân dân. Vì vậy, việc phân tích so sánh các mẫu Giảo cổ lam và lựa chọn dược liệu sử dụng để đảm bảo chất lượng thuốc là hết sức cần thiết. Những nghiên cứu để đưa ra các tiêu chuẩn truyền thống về Giảo cổ lam trước đây như cảm quan về hình thái, đặc điểm vi phẫu, chỉ thị hóa học… rất khó để đánh giá chính xác chất lượng Giảo cổ lam. Vì vậy, việc phân tích thành phần hóa học đặc biệt là thành phần saponin để bước đầu xây dựng tiêu chuẩn vân tay hóa học của Giảo cổ lam là rất quan trọng và và có ý nghĩa thực tiễn trong kiểm soát nguồn gốc và chất lượng của dược liệu này. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, khóa luận “Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng” được thực hiện với 2 mục tiêu: - Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino. - So sánh thành phần saponin giữa các loài GCL thuộc chi Gynostemma ở Việt Nam. [...]... cỏc iu kin tin hnh sc ký lp mng - Phng phỏp chun b dch chit: Theo mc 1.1.2.1 saponin trong Gio c lam thuc nhúm dammaran, xut hin nhiu trong cỏc cõy thuc chi Panax L., h Araliaceae Saponin l hp cht phõn cc mnh, tan tt trong n BuOH Cỏc ti liu [25], [30], [41], [43] ó nghiờn cu v thnh phn saponin trong mt s loi Nhõn sõm, kt qu cho thy n BuOH bóo hũa nc chit xut c phn ln saponin trong dc liu Vỡ vy, khúa... thuc nhúm Saponin triterpen tetracyclic Cỏc nghiờn cu u tiờn ó phỏt hin saponin cú mt trong Gio c lam thuc nhúm dammaran (hỡnh 1.1) Dammaran l nhúm saponin triterpenic cú cu trỳc 4 vũng (triterpenoid tetracyclic) Trong cụng thc phõn t cú 30 carbon v do 6 nhúm hemiterpen ghộp li theo qui tc u uụi Cỏc saponin thuc nhúm ny xut hin nhiu trong cỏc cõy thuc chi Panax L., h Araliaceae c bit cỏc saponin trong. .. dch chit 2 : 1 (chit t 2 gam dc liu v cụ dch chit trong n BuOH n 1 ml) vi cỏc th tớch chm sc ký sau: 1àl; 2àl; 3àl; 4àl; 5àl 2.3.2.nh tớnh saponin trong Gio c lam bng sc ký lp mng Cỏc mu dch chit c chm trờn bn mng silicagel GF254 bng mỏy Linomat 5.0, chp nh sc ký bng h thng mỏy CAMAG REPROSTAR 3 cựng phn mm winCATS 20 - Thớ nghim 1: nh tớnh saponin trong 13 mu ca loi G pentaphyllum (Thunb.) Makino,... thnh phn saponin trong Gio c lam cú nhiu im tng ng vi thnh phn saponin trong cỏc cõy thuc chi Panax L nh tớnh saponin trong Nhõn sõm bng SKLM, s dng h dung mụi CHCl3: MeOH: H2O vi nhiu t l khỏc nhau nh sau (7: 3: 1); (7: 3: 0,8); (7: 3: 0,5); (7: 3 : 0,25) cho thy kh nng phõn tỏch tt [41], [44] Vỡ vy, khúa lun ó s dng h dung mụi CHCl3: MeOH: H2O v iu chnh thnh t l (7: 3: 0,4) (I) khai trin sc ký, kt... t ra l nh tớnh saponin trong dc liu GCL, khi tham kho ti liu nghiờn cu v thnh phn húa hc ca GCL thỡ saponin trong dc liu ny thuc nhúm triterpenoid, trong cu trỳc hu nh khụng cú cỏc liờn kt ụi liờn hp, nờn cỏc hp cht ny khụng phỏt hunh quang bc súng 366 nm Kt hp vi hỡnh nh sc ký ca 13 mu GCL (hỡnh 3.4), chỳng tụi nhn thy hỡnh nh cỏc vt ny khụng cú giỏ tr c trng cho cỏc hp cht saponin trong GCL Do ú,... sc ký lp mng trong khúa lun c tin hnh theo nhng iu kin nh sau: - Dch chm sc ký c chun b theo phng phỏp chit xut bng n BuOH bóo hũa nc - Th tớch dch chit chm lờn bn mng: 3àl - H dung mụi khai trin: CHCl3 : MeOH : H2O (7 : 3 : 0,4) - Sau khi khai trin, sc ký c quan sỏt di ỏnh sỏng t ngoi cú bc súng 254nm, 366nm v hin mu bng thuc th vanillin acid sulfuric 3.1.2 nh tớnh saponin trong dc liu Gio c lam. .. trng Hũa Bỡnh (TR, NN): Sc ký ca hai mu ny tng t nhauvi 4 vt cú giỏ tr Rf bng 0,78; 0,61; 0,43; 0,24 Riờng mu trng trong rõm (TR) xut hin thờm 2 vt Rf bng 0,71 v 0,32 + Mu Gio c lam ngt thu hỏi Hũa Bỡnh (GN): Trờn sc ký ca mu ny, cỏc vt xut hin nht hn so vi 12 mu khỏc mu ny xut hin 5 vt nht trờn sc ký vi giỏ tr Rf bng 0,78; 0,71; 0,61; 0,24 v 0,14 Nh vy, khi quan sỏt sc ký ỏnh sỏng t ngoi cú... khỏc nhau vi cỏc hp cht khỏc nhau - Kho sỏt th tớch chm sc ký: Ding Shuli, Zhu Zhaoyi ó nghiờn cu hm lng saponin trong 7 loi thuc chi Gynostemma Blume trong ú cú cỏc loi G pentaphyllum (Thunb.) Makino, G.laxum (Wall.) Cogn., G longipes C.Y.W Kt qu lỏ v thõn ca cỏc loi ny u cha 2,37 6,98% saponin (so vi trng lng khụ) [50] m bo hỡnh nh sc ký cho cỏc vt phõn tỏch rừ rng thun li cho phõn tớch kt qu,... phn trong cõy v l minh chng u tiờn ca nhúm saponin nhõn sõm c tỡm thy ngoi h Araliaceae [32] Mt s Gypenosid XXVIII, XXXVII, LV, LXII, LXIII cng tỡm thy trong loi Gynostemma sylvestre (Retz) Schult [48] Cỏc saponin cũn li chim phn ln cỏc gypenosid c phỏt hin ln u loi G pentaphyllum (Thunb.) Makino R6 R4 20 R5 R7 a b CH2OH c OH OH 17 18 R3 R2 1 OOH 9 O e d f 30 R1 O OCH3 28 29 Hỡnh 1.2a Cu trỳc saponin. .. Makino R6 R4 20 R5 R7 a b CH2OH c OH OH 17 18 R3 R2 1 OOH 9 O e d f 30 R1 O OCH3 28 29 Hỡnh 1.2a Cu trỳc saponin trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino g OH CH2O Glu h O Rha i Hỡnh 1.2b Cỏc dng cu trỳc R7 Hỡnh 1.2 Khung cu trỳc saponin trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino 7 Bng 1.1 Saponin thng gp trong G pentaphyllum (Thunb.) Makino Cỏc nhúm th R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 ng glu, rham, xyl, cú th 1 hoc 2, 3 ng . nghiên cứu 18 2.3.1. Khảo sát các điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 18 2.3.2. Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng 193 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21. điều kiện tiến hành sắc ký lớp mỏng 21 3.1.1.1.Chuẩn bị dịch chiết 21 3.1.1.2. Điều kiện sắc ký 21 3.1.2. Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam 24 3.1.2.1. Định tính các mẫu thuộc. nghĩa thực tiễn trong kiểm soát nguồn gốc và chất lượng của dược liệu này. Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, khóa luận Định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng sắc ký lớp mỏng được thực