Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Ý dĩ là loài cây bản địa của Việt Nam, từ lâu đã được trồng như một cây thuốc quý và cây tinh bột nhiều bổ dưỡng. Hầu hết các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về Ý dĩ mới chỉ tập trung trên hạt là bộ phận được dùng phổ biến nhất. Bên cạnh hạt Ý dĩ, thân cây cũng được một số người dân sử dụng để điều trị đái tháo đường và là một thành phần trong bài thuốc điều trị sỏi tiết niệu. Tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của thân cây Ý dĩ đã được chứng minh trên cả mô hình in vitro và in vivo. Từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat thân cây Ý dĩ, nhóm nhiên cứu của chúng tôi đã phân lập được acid p coumaric là một thành phần có tác dụng ức chế mạnh sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro với giá trị IC50 là 2,35 mM 13. Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào để xác định hàm lượng acid pcoumaric trong thân cây Ý dĩ. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Xây dựng phương pháp định lượng acid pcoumaric trong thân cây Ý dĩ ” với hai mục tiêu sau: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid pcoumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC. Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng acid p coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ.
ii BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM PHƯƠNG THẢO XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID P-COUMARIC TRONG THÂN CÂY Ý DĨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM PHƯƠNG THẢO XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ACID P-COUMARIC TRONG THÂN CÂY Ý DĨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Quỳnh Chi 2. DS. Nguyễn Thị Thảo Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược liệu 2. Phòng hóa phân tích- VDL HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất đến TS.Nguyễn Quỳnh Chi, TS.Phương Thiện Thương và DS.Nguyễn Thị Thảo là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tận tình giúp em hoàn thành khóa luận này. Em cũng xin được gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội và phòng hóa phân tích Viện Dược Liệu đã giúp đỡ em trong quá trình làm thực nghiệm. Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến tất cả các thầy cô của trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, trang bị kiến thức cho em trong suốt 5 năm học vừa qua. Em cũng xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè – những người thường xuyên động viên và tạo điều kiện cho em trong thời gian qua. Em xin chân thành cám ơn các quý vị đại biểu và các bạn đã đến tham dự buổi bảo vệ. Hà Nội, tháng 5 năm 2014. Sinh viên Phạm Phương Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về cây Ý dĩ 2 1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 2 1.1.3. Bộ phận dùng, chế biến, công dụng theo y học cổ truyền 4 1.1.4.Thành phần hóa học của cây Ý dĩ 4 1.1.5. Tác dụng dược lí 6 1.2. Tổng quan về acid p-coumaric 7 1.2.1. Công thức cấu tạo 7 1.2.2. Tính chất hóa lý 8 1.2.3. Nguồn gốc 8 1.2.3. Các phương pháp định lượng acid p-coumaric trên thế giới 8 1.2.4. Tác dụng sinh học 9 1.2.5. Vai trò của acid p-coumaric trong Ý dĩ 9 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 10 2.1.1. Nguyên vật liệu 10 2.1.2. Hoá chất và dung môi 11 2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu 11 2.2. Nội dung nghiên cứu 12 2.3. Phương pháp nghiên cứu 12 2.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC 12 2.3.2. Áp dụng phương pháp đã được xây dựng để xác định hàm lượng acid p-coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ 14 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 15 3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng phương pháp HPLC 15 3.1.1. Khảo sát quá trình xử lí mẫu 15 3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc kí 16 3.1.3. Thẩm định phương pháp phân tích 22 3.2. Kết quả định lượng acid p-coumaric trên các mẫu thân Ý dĩ 28 3.3. Bàn luận 30 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A S : Hệ số đối xứng pic CE-MS: Capillary Electrophoresis with Mass Spectrometry COD: Calci oxalat dihydrat COM: Calci oxalat monohydrat DAD: Detector mảng Diod (Diode-Array Detector) ESI-MS: Electrospray Ionisation-Mass Spectrometry EtOAc: Ethyl acetat HPLC:Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) LOD: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH: Methanol MS: Mass Spectroscopy R S : Độ phân giải RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard devition) SKLM: Sắc kí lớp mỏng t R : Thời gian lưu UV: Ultra violet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng……………………………… Bảng 3.1: Các thông số HPLC của hệ dung môi 1 và hệ dung môi 2…………. Bảng 3.2: Chương trình dung môi 1 cho chế độ rửa giải gradient …………… Bảng 3.3: Chương trình dung môi 2 cho chế độ rửa giải gradient…………… Bảng 3.4: Các thông số HPLC của chương trình dung môi 1 và 2……………. Bảng 3.5: Các thông số HPLC của hệ acid 1 và hệ acid 2…………………… Bảng 3.6: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD…………………………… Bảng 3.7: Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính………………………………… Bảng 3.8: Kết quả khảo sát đường chuẩn……………………………………… Bảng 3.9: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống………………………. Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp bằng mẫu 3………… Bảng 3.11: Kết quả khảo sát tỷ lệ thu hồi…………… ……………………… Bảng 3.12: Kết quả định lượng acid p-coumaric trong một số mẫu Ý dĩ…… Bảng 3.13: Hàm lượng trung bình (kl/kl) của acid p-coumaric trong các mẫu Ý dĩ……………………………………………………………………………. DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Công thức cấu tạo của acid acid p-coumaric……………………… Hình 2.1: Cây Ý dĩ…………………………………………………………… Hình 3.1: Sắc kí đồ hệ dung môi 1…………………………………………… Hình 3.2: Sắc kí đồ hệ dung môi 2…………………………………………… Hình 3.3: Sắc kí đồ chương trình dung môi 1………………………………… Hình 3.4: Sắc kí đồ chương trình dung môi 2………………………………… Hình 3.5: Sắc kí đồ của hệ acid 1…………………………………………… Hình 3.6: Sắc kí đồ của hệ acid 2…………………………………………… Hình 3.7: Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 3 và mẫu acid p-coumaric đối chiếu………………………………………………………………………… Hình 3.8: Đường chuẩn và phương trình hồi quy acid p-coumaric…………… Hình 3.9: Sắc kí đồ HPLC của mẫu dược liệu 1,2,3 và mẫu acid p-coumaric đối chiếu……………………………………………………………………… 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ý dĩ là loài cây bản địa của Việt Nam, từ lâu đã được trồng như một cây thuốc quý và cây tinh bột nhiều bổ dưỡng. Hầu hết các nghiên cứu trong nước và trên thế giới về Ý dĩ mới chỉ tập trung trên hạt là bộ phận được dùng phổ biến nhất. Bên cạnh hạt Ý dĩ, thân cây cũng được một số người dân sử dụng để điều trị đái tháo đường và là một thành phần trong bài thuốc điều trị sỏi tiết niệu. Tác dụng điều trị sỏi tiết niệu của thân cây Ý dĩ đã được chứng minh trên cả mô hình in vitro và in vivo. Từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat thân cây Ý dĩ, nhóm nhiên cứu của chúng tôi đã phân lập được acid p- coumaric là một thành phần có tác dụng ức chế mạnh sự hình thành tinh thể calci oxalat in vitro với giá trị IC 50 là 2,35 mM [13]. Tuy nhiên hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào để xác định hàm lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “ Xây dựng phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ ” với hai mục tiêu sau: - Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng acid p-coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC. - Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng acid p- coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ. 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây Ý dĩ 1.1.1. Vị trí phân loại Cây Ý dĩ thuộc chi Coix L., họ Lúa (Poaceae), bộ Lúa (Poales), phân lớp Thài Lài (Commelinidae), lớp Hành ( Liliopsida), ngành Ngọc Lan ( Magnoliophyta) [5]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố Ý dĩ là một loại cây thảo sống hàng năm, cao chừng 1- 1,5 m.Thân nhẵn bóng có vạch dọc.Thân có phân nhánh, các mấu phía dưới có thể mọc rễ phụ, cây mọc thành bụi. Lá hình mác dài 10- 40 cm, rộng 1,5- 3 cm, gân dọc nổi rõ, gân giữa to. Hoa đơn tính cùng gốc mọc ở kẽ lá thành bông, hoa đực mọc phía trên, hoa cái phía dưới. Hoa đực có 3 nhị. Quả có mày cứng bao bọc [1],[4]. Ý dĩ mọc tự nhiên phân bố rải rác ở một số tỉnh miền núi phía bắc như Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu…Cây thường mọc gần nguồn nước, dọc bờ khe suối ở cửa rừng hay trong thung lũng. Ý dĩ trồng thường không cố định theo khu vực. Vào đầu những năm 90, cây được trồng nhiều ở Kon Tum, Đồng Nai…Từ năm 1995-1997 ở Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình (Mai Châu) và Hà Tây…Việt Nam là nước trồng nhiều Ý dĩ trong khu vực trong những năm 80 và 90. Ý dĩ của Việt Nam thường xuyên được xuất ra thị trường thế giới [10],[12]. Ở Việt Nam xác định Ý dĩ có 4 thứ sau [5],[8] : - Coix lachryma – jobi L.var. lachryma –jobi L: Cườm gạo Cây cỏ, thân có đường kính 8-10 mm. Lá phẳng, cuống dài 40-50 cm, rộng 4-5 cm, gân giữa to, gân bên rất mảnh, bẹ nhẵn, lưỡi nhỏ 1mm. Cụm hoa ở ngọn nhánh. Bông chét đực ở trên dài 6-7 cm. Nhị vàng. Bông chét cái ở [...]... phương ph p đã được xây dựng để xác định hàm lượng acid p- coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ p dụng phương ph p đã được xây dựng để định lượng acid p- coumaric trong thân 3 mẫu Ý dĩ, mỗi mẫu được định lượng 3 lần, lấy kết quả trung bình 15 Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng và thẩm định phương ph p định lượng acid p- coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng phương ph p HPLC 3.1.1 Khảo sát... lần Lượng acid p- coumaric Tỷ lệ thu hồi định lượng thêm vào ( mg) (%) 1 5,8 80,04 2 5,8 80,51 3 5,9 81,48 4 5,9 82,25 5 6,1 81,23 6 6,1 83,17 28 Tỷ lệ thu hồi trung bình của phương ph p định lượng acid p- coumaric bằng phương ph p HPLC là 81,47% 3.2 Kết quả định lượng acid p- coumaric trên các mẫu thân Ý dĩ p dụng quy trình đã xây dựng được để định lượng acid p- coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ, ... cao HPLC-LC 10A (Shimadzu) Đèn tử ngoại Vilbez Lourmat (hai bước sóng λ = 254 nm và λ = 366 nm) Máy đo độ ẩm Sartorius Pipet vạch, pipet pasteur, pipet chính xác, bình gạn… 12 2.2 Nội dung nghiên cứu - Xây dựng và thẩm định phương ph p định lượng acid p- coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) - p dụng phương ph p đã được xây dựng để xác định hàm lượng acid pcoumaric trong. .. trong các mẫu thân cây Ý dĩ 2.3 Phương ph p nghiên cứu 2.3.1 Xây dựng và thẩm định phương ph p định lượng acid p- coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC 2.3.1.1 Khảo sát quá trình xử lí mẫu Dựa vào độ tan của acid p- coumaric để lựa chọn dung môi chiết xuất cho phù h p Sau đó tiến hành khảo sát quá trình xử lí mẫu ti p theo để loại t p chất trong dịch chiết 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc kí Ph p phân tích... loại thực phẩm như: lạc, đậu xanh, cà chua, cà rốt, tỏi, rượu vang, giấm và lúa mạch Ngoài ra acid p- coumaric cũng đã được phân l p từ hạt Ý dĩ [25] 1.2.3 Các phương ph p định lượng acid p- coumaric trên thế giới Acid p- coumaric có mặt khá phổ biến trong thực vật Trên thế giới đã có các nghiên cứu p dụng phương ph p sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector mảng diod (DAD) [34], phương ph p phun mù... (µg/ml) P: Độ tinh khiết của chất chuẩn ( Pacid p- coumaric chuẩn = 0,996) M: Khối lượng mẫu dược liệu đem phân tích (mg) B: Độ ẩm của mẫu dược liệu (%) Độ l p lại của phương ph p được xác định bằng cách tiến hành 6 thí nghiệm riêng biệt để định lượng một mẫu thân Ý dĩ (mẫu 3) Kết quả khảo sát độ l p lại của phương ph p được trình bày trong bảng 3.10 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát độ l p lại của phương ph p. .. chất phân tích không quá lớn nhưng phải đảm bảo tách xa nhau [3],[6] 2.3.1.3 Thẩm định phương ph p phân tích Sau khi khảo sát quá trình xử lí mẫu và các điều kiện sắc kí, tiến hành thẩm định phương ph p định lượng acid p- coumaric bằng HPLC trong Ý dĩ: Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ th p nhất của chất phân tích mà hệ thống phân... về acid p- coumaric 1.2.1 Công thức cấu tạo Hình 1.1 Công thức cấu tạo của acid acid p- coumaric 8 -Công thức phân tử: C9H8O3 -Khối lượng phân tử: 164,16 g.mol-1 -Tên khoa học: (E)- 3- (4-hydroxyphenyl)- 2- propenoic acid 1.2.2 Tính chất hóa lý Acid p- coumaric là một acid hydroxyl cinnamic, là h p chất hữu cơ mà nhóm OH được gắn vào acid cinnamic Acid coumaric có 3 đồng phân: acid o -coumaric, acid m -coumaric. .. và acid p- coumaric, khác nhau ở vị trí gắn nhóm OH vào acid cinnamic Trong đó acid p- coumaric là dạng đồng phân được tìm thấy nhiều nhất trong tự nhiên Acid p- coumaric tồn tại ở 2 dạng: trans -p- coumaric và cis -p- coumaric Dạng tinh thể rắn của acid p- coumaric hơi tan trong nước nhưng tan tốt trong ethanol, methanol và diethyl ether 1.2.3 Nguồn gốc Acid p- coumaric là một acid hữu cơ được tìm thấy trong. .. phun mù điện tử ( ESI-MS) [36] và một số phương ph p kết h p giữa HPLC và ESI-MS, CE-MS [23],[41], để tiến hành định lượng acid p- coumaric trên các mẫu thực tế Các phương ph p này đã được p dụng để định lượng acid p- coumaric trong một số thực phẩm như: dầu ôliu [36], một số loài đậu (Phaseolus vulgaris L.) [34], nho [41], lúa mạch và ngũ cốc [35], lạc (Arachis hypogaea L.) [31], quả thuộc họ Citrus [23] . và thẩm định phương ph p định lượng acid p- coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC. - p dụng phương ph p đã xây dựng để xác định hàm lượng acid p- coumaric trong một số mẫu thân cây Ý dĩ. . - Xây dựng và thẩm định phương ph p định lượng acid p- coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). - p dụng phương ph p đã được xây dựng để xác định hàm lượng acid. hàm lượng acid p- coumaric trong các mẫu thân cây Ý dĩ. 2.3. Phương ph p nghiên cứu 2.3.1. Xây dựng và thẩm định phương ph p định lượng acid p- coumaric trong thân cây Ý dĩ bằng HPLC 2.3.1.1.