BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : TS . Phạm Thị Thanh Hà ThS . Ngô Quang Trung Nơi thực hiện: Phòng phân tích, kiểm nghiệm & TĐSH- Viện công nghệ dược phẩm Quốc Gia. HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến: TS. Phạm Thị Thanh Hà ThS. Ngô Quang Trung Là người thầy, người cô đã luôn tận tình hướng dẫn tôi, và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, và các anh chị tại Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học - Viện công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành được khóa luận. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô tại các bộ môn của Trường Đại Học Dược Hà Nội, đã truyền dạy kiến thức và niềm tự hào là sinh viên trường Dược cho tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Hoàng Thị Quỳnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về sildenafil 3 1.1.1. Công thức 3 1.1.2. Tính chất 3 1.1.3. Tác dụng của Sildenafil 4 1.1.3.1. Cơ chế tác dụng của Sildenafil 4 1.1.3.2. Dược động học 4 1.1.3.3. Chỉ định 5 1.1.3.4. Liều dùng 5 1.1.3.5. Tác dụng không mong muốn của Sildenafil 5 1.1.3.6. Tương tác thuốc 6 1.1.4. Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược 7 1.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 7 1.2.1. Nguyên tắc 7 1.2.2. Pha tĩnh 8 1.2.3. Pha động 9 1.2.4. Kỹ thuật 10 1.2.4.1. Đưa chất phân tích lên bản mỏng 10 1.2.4.2. Khai triển sắc ký 11 1.2.4.3. Phát hiện vết trên sắc ký đồ 12 1.2.5. Ứng dụng của SKLM 13 1.2.5.1. Định tính 13 1.2.5.2. Thử tinh khiết 14 1.2.5.3. Định lượng 14 1.2.6. Ưu nhược điểm 14 1.2.6.1. Ưu điểm 14 1.2.6.2. Nhược điểm 15 1.3. Phương pháp xử lý mẫu 15 1.3.1. Chiết hệ dị thể rắn-lỏng 15 1.3.2. Chiết Soxhlet 16 1.3.3. Chiết pha rắn (SPE) 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Phương tiện nghiên cứu 17 2.1.1. Máy móc, thiết bị 17 2.1.2. Hóa chất thuốc thử 17 2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.2.2. Nội dung nghiên cứu 19 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu 19 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích 20 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 20 3.1.2. Khảo sát điều kiện phát hiện 21 3.1.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 23 3.2.Đánh giá phương pháp 25 3.2.1. Độ chọn lọc 25 3.2.2. Độ lặp lại 26 3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD) 29 3.3. Áp dụng phương pháp kiểm tra một số mẫu 32 3.3.1. Quy trình xử lý mẫu thử và điều kiện khai triển sắc ký 32 3.3.2. Xích Thố Vương 1 33 3.3.3. Xích Thố Vương 2 33 3.3.4. Xích Thố Vương 3 34 3.3.5. YANGCHUNSAMNOK. 34 3.3.6. ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS Velours. 35 3.3.7. YANGCHUNSAMROK. 35 3.4. Bàn luận 36 KẾT LUẬN 37 ĐỀ XUẤT 38 TLTK DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT PDE-5 Phosphodiesterase-5 MeOH Methanol NO Nitơ (II) oxid cGMP cyclic Guanosine Monophosphate PAH Pulmonary Arterial Hypertension (tăng áp động mạch phổi) CYP Cytochrome P450 ED Erectile Dysfunction (rối loạn cương dương) SKLM Sắc Ký Lớp Mỏng IR Infrared (Hồng ngoại) HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) TLC Thin- Layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) MS Mass spectra( khối phổ) HPTLC High-performance Thin- Layer chromatography( Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) TLTK Tài liệu tham khảo SKĐ Sắc ký đồ UV Ultraviolet (Tử ngoại) SPE Solid Phase extraction (Chiết pha rắn) SC Sildenafil citrate SD Sildenafil S/N Signal/Noise LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp phát hiện sildenafil. 7 Bảng 1.2 Một số chất thường làm pha tĩnh cho sắc ký lớp mỏng 9 Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong sắc ký lớp mỏng 12 Bảng 2.1 Một số sản phẩm đông dược ứng dụng kiểm tra. 18 Bảng 3.1 Kết quả tính độ lặp lại. 29 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi khai triển 20 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát điều kiện phát hiện vết 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc 26 Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại 27 Hình 3.6 Sắc ký đồ analog xác định độ lặp lại 28 Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện 30 Hình 3.8 Sắc ký đồ analog của mẫu xác định giới hạn phát hiện 31 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 1 33 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 2 33 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 3 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu YANGCHUNSAMNOK 34 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS Velours 35 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu YANGCHUNSAMROK 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, khi kinh tế ngày càng phát triển, con người có điều kiện quan tâm đến sức khỏe nhiều hơn. Cùng xu hướng ưa chuộng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên với niềm tin chúng an toàn, hiệu quả hơn. Nắm bắt xu thế đó, các cơ sở sản xuất chế phẩm đông dược đã đưa ra thị trường rất nhiều mặt hàng nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Tuy nhiên, nhà sản xuất vì nhiều mục đích như lợi nhuận, giảm nhanh các triệu chứng hay tạo cảm giác đánh lừa người tiêu dùng (tăng cân nhanh do tác dụng giữ nước) , mà đã cố tình trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế phẩm đông dược. Điều này không được thông báo khiến người tiêu dùng vì không biết đã sử dụng thuốc với một liều lớn trong thời gian kéo dài, đây có thể là nguyên nhân gây ra các tác dụng không mong muốn về sau cho người dùng thậm chí là nguy hiểm đến tính mạng. Các nhóm thuốc thường được sử dụng là: glucocorticoid, nhóm giảm đau chống viêm không steroid, nhóm ức chế PDE-5…đây là những thuốc cho tác dụng nhanh và mạnh vì vậy mà chúng bị lạm dụng nhiều. Chính vì vậy mà hiện nay nước ta đã có quy định cụ thể nghiêm cấm trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế phẩm đông dược, tuy nhiên việc kiểm soát còn gặp nhiều khó khăn. Sildenafil là một chất thuộc nhóm ức chế PDE-5. Năm 1998, sildenafil với tên biệt dược là Viagra đã được FDA công nhận làm thuốc và cũng là thuốc đầu tiên điều trị rối loạn cương dương trên thế giới. Chính nhờ tác dụng của nó mà việc lạm dụng thuốc và tình hình trộn trái phép sildenafil vào các chế phẩm đông dược ngày càng gia tăng. Trong báo cáo thường niên của hội đồng dược điển Mỹ (USP) năm 2007 đã nêu rõ rằng: “trộn sildenafil và dẫn chất” trở thành vấn đề mang tính toàn cầu [17]. [...]... định kiểm tra tạp chất có mặt trong dược chất bằng SKLM 1.2.5.3 Định lượng Bằng các biện pháp chính xác hóa lượng mẫu đưa lên bản mỏng có thể sử dụng SKLM để định lượng Tùy theo phương tiện sử dụng mà độ chính xác của phép định lượng ở cấp độ khác nhau: Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký: - Định lượng chất phân tích sau khi tách chiết ra khỏi bản mỏng bằng dung môi thích hợp - Định lượng. .. amoniac vào nước sẽ làm tăng độ tan của base hoặc acid tương ứng  Khi dùng silicagel hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số Rf của chúng Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic vào dung môi không phân cực như methylbenzen sẽ làm tăng đáng kể trị số Rf 1.2.4 Kỹ thuật [1], [11], [13] Bản sắc ký thường có kích... dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha Tuy nhiên lựa chọn tối ưu hóa sắc ký thường dựa chủ yếu vào kinh nghiệm Sau đây là một số gợi ý chung nhất cho pha động của SKLM:  Dung môi cần có độ tinh khiết cao 10  Cần điều chỉnh sức rửa giải của pha động để trị số Rf nằm trong khoảng 0,2 ÷ 0,8 đạt độ phân giải cực trị  Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp... mỏng Sự tách các chất khác nhau cũng phụ thuộc vào tính phân cực của các thành phần trong pha động Cơ chế tách có thể là phân bố, hấp phụ, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hoặc phối hợp nhiều cơ chế Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động: Rf... vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân tích Một số chất thường được dùng làm pha tĩnh cho SKLM kèm theo cơ chế sắc ký và ứng dụng được trình bày trong bảng sau: 9 Bảng 1.2 Một số chất thường làm pha tĩnh cho SKLM Pha tĩnh Cơ chế sắc ứng dụng phân tích ký Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon, alkaloid, vitamin Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid... chọn lọc cao 3.2.2 Độ lặp lại Xác định độ lặp lại: Chiết lặp lại 6 mẫu lai nhiễm Sildenafil giống nhau với lượng SC thêm vào các mẫu đều bằng 1ml dung dịch chuẩn gốc 1mg/ml Sau đó dịch chiết thu được đem chấm sắc ký Đánh giá độ lặp lại bằng vi c quan sát các vết 27 của 6 mẫu trên SKĐ, đồng thời đánh giá bằng diện tích pic vết của 6 mẫu nhờ sự trợ giúp của phần mềm Videoscan Tính RSD của Spic, yêu cầu... hòa tan các chất phân tích Nếu thời gian không ảnh hưởng đến chất phân tích thì có thể ngâm mẫu trong dung môi cần chiết vài giờ hoặc qua đêm  Nếu chiết bằng dung môi kém phân cực thì hàm ẩm không được quá lớn Thông thường để tăng hiệu quả và rút ngắn thời gian chiết người ta có thể sử dụng các tác nhân vật lý như nhiệt độ, siêu âm… 16 - Ứng dụng: kỹ thuật chiết rắn-lỏng được áp dụng phổ biến cho các... mặt pha động 0,8 ÷ 1,0 cm Các vết chấm phải nhỏ, đường kính 2-6 mm và cách nhau khoảng 15mm Các vết ở bìa phải cách bờ khoảng 1 cm Trong trường hợp bản định lượng phải dùng mao quản định mức chính xác vì độ tin cậy của kết quả phụ thuộc vào lượng chất phân tích đưa lên bản mỏng 1.2.4.2 Khai triển sắc ký [1], [11] Thiết bị khai triển sắc ký thường là bình thủy tinh trong suốt có nút xoáy kín Thường dùng... thức phân tử: C22H30N6O4S -Phân tử lượng: 474,59 1.1.2 Tính chất [10], [14] + Màu trắng hoặc màu trắng ngà + Nhiệt độ nóng chảy: 187o-189 oC + Độ tan: Sildenafil citrate ít tan trong methanol (3,5mg/ml), độ tan của SC phụ thuộc vào pH và giảm dần theo sự tăng pH pH trong phạm vi 3,7-3,8, pKa 8,2-9,6 + Tồn tại ở dạng muối liên kết với acid citric (C22H 30N6O4S.C6H8O 7) 4 Tên biệt dược: Revatio 20mg Viagra... lượng máu đến thể hang dương vật Sildenafil làm tăng tác dụng của NO bởi ức chế enzyme phosphodiesterase-5 (PDE-5) một enzyme thoái hóa cGMP trong thể hang dương vật - Điều trị tăng áp động mạch phổi (PAH): ức chế PDE-5 ở cơ trơn động mạch phổi Kết quả của tăng nồng độ cGMP là gây giãn cơ trơn động mạch phổi 1.1.3.2 Dược động học [10], [21] + Hấp thu: nhanh, chậm hơn khi ăn bữa ăn giàu chất béo + Phân . trị số R f nằm trong khoảng 0,2 ÷ 0,8 đạt độ phân giải cực trị.  Chất phân tích dạng ion hay phân cực được rửa giải tốt bằng dung môi phân cực như hỗn hợp n-BuOH – H 2 O. Thêm một ít acid. hoặc các chất hấp phụ phân cực khác, độ phân cực của pha động sẽ quyết định tốc độ di chuyển của chất phân tích và trị số R f của chúng. Nếu thêm một ít dung môi ít phân cực như ether ethylic. Pha tĩnh Cơ chế sắc ký ứng dụng phân tích Silica Hấp phụ Acid amin, hydrocarbon, alkaloid, vitamin Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid