BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY LINH ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY LINH ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG CÂY TRỒNG LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Quốc Huy DS. Nguyễn Vũ Minh Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Quốc Huy, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới: DS. Nguyễn Vũ Minh, người đã hướng dẫn tận tình, đóng góp những ý kiến quý báu và luôn tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. DS.Nghiêm Đức Trọng, DS. Tạ Khắc Công đã hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn. Tập thể giảng viên, kỹ thuật viên bộ môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Em Phạm Thị Việt Hồng – M2K65, em Lê Thiên Kim – A1K66, em Lê Trọng Sơn - A2K66 đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn. Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học qua, cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên tôi. Hà Nội, 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN………………………………………………… 3 1.1. LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU…………………………… 3 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố……………………………………………. 3 1.1.2. Thành phần hóa học……………………………………………………… 4 1.1.3. Tác dụng sinh học và công dụng…………………………………………. 5 1.1.3.1. Tác dụng sinh học……………………………………………………… 5 1.1.3.2. Công dụng……………………………………………………………… 5 1.2. OXOSTEPHANIN…………………………………………………………. 5 1.2.1. Công thức phân tử và tính chất vật lý……………………………………. 6 1.2.2. Tác dụng dược lý………………………………………………………… 6 1.3. SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO………………………………. 6 1.3.1. Sắc ký lớp mỏng………………………………………………………… 6 1.3.1.1. Nguyên tắc…………………………………………………………… 6 1.3.1.2. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng……………………………………………… 8 1.3.2. Đặc điểm chung của sắc ký lớp mỏng hiệu năng hiệu năng cao – HPTLC………………………………………………………………………… 10 1.3.3. Ứng dụng của HPTLC trong nghiên cứu dược liệu…………………… 10 1.3.2.1. Định tính……………………………………………………………… 10 1.3.2.2. Bán định lượng………………………………………………………… 12 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 14 2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU………………………… 14 2.1.1. Nguyên liệu………………………………………………………………. 14 2.1.1. Hóa chất và dụng cụ…………………………………………………… 17 2.1.1.1. Máy móc và dụng cụ thí nghiệm………………………………………. 17 2.1.1.2. Hóa chất……………………………………………………………… 18 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………… 18 2.2.1. Nội dung nghiên cứu …………………………………………………… 18 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu………………………………………………… 18 2.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng…………………………………… 18 2.2.2.2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây……………. 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………………………… 24 3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM……………………………………………… 24 3.1.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC………………………. 24 3.1.1.1. Xử lý mẫu thử…………………………………………………………. 24 3.1.1.2. Lựa chọn khoảng nồng độ của dãy dung dịch oxostephanin chuẩn…… 25 3.1.1.3. Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC……………………………. 26 3.1.1.4. Thẩm định phương pháp định lượng…………………………………… 26 3.1.2. Định lượng oxostephanin trong cây trồng loài S.dielsiana……………… 29 3.1.3. Đánh giá hàm lượng oxstephanin trong cây trồng loài S.dielsiana……… 30 3.1.3.1. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các bộ phận khác nhau của cùng 1 cây………………………………………………………………… 30 3.1.3.2. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong các mẫu theo các độ tuổi khác nhau………………………………………………………………… 32 3.1.3.3. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin tích lũy trong mẫu cây trồng từ hạt và cây trồng từ hom……………………………………………………… 33 3.1.3.4. Kết quả so sánh hàm lượng oxostephanin trong mẫu củ trưởng thành theo các mùa khác nhau………………………………………………………… 34 3.2. BÀN LUẬN……………………………………………………………… 35 3.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng ……………………………………… 35 3.2.2. Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong cây……………. 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………… 39 KẾT LUẬN…………………………………………………………………… 39 KIẾN NGHỊ……………………………………………………………………. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 PHỤ LỤC 5 PHỤ LỤC 6 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT GACP Good Agricultural and Collection Practices IR Infrared Radiation HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy HPLC High Performance Liquid Chromatography MS Mass spectrometry NMR Nuclear magnetic resonance SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự S. Stephania TLC Thin Layer Chromatography UV Ultraviolet DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Một số chất làm pha tĩnh cho TLC……………………………… 7 Bảng 1.2. Một số thuốc thử tạo màu trong nghiên cứu dược liệu…………… 9 Bảng 2.1. Danh mục các mẫu cây nghiên cứu………………………………. 16 Bảng 2.2. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn (mg/ml)…………… 19 Bảng 3.1. Nồng độ oxostephanin chuẩn và diện tích pic đáp ứng………… 27 Bảng 3.2. Giá trị Rf và diện tích pic của các vết…………………………… 28 Bảng 3.3 . Kết quả khảo sát độ đúng……………………………………… 29 Bảng 3.4. Kết quả định lượng oxostephanin bằng HPTLC…………………. 30 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phương sai…………………………………… 31 Bảng 3.6. So sánh hàm lượng oxostephanin theo các cặp mẫu cây trồng từ hạt và cây trồng từ hom……………………………………………………… 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cụm hoa đực và hoa đực…………………………………………… 3 Hình 1.2. Cụm hoa cái………………………………………………………… 3 Hình 1.3. Quả xanh và hạt………………………………………………………. 4 Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của oxostephanin………………………………… 6 Hình 2.1. Vườn trồng củ dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội…………………. 14 Hình 2.2. Củ loài S. dielsiana…………………………………………………… 15 Hình 2.3. Thân lá non loài S. dielsiana…………………………………………. 15 Hình 2.4. Thân lá bánh tẻ loài S. dielsiana…………………………………… 15 Hình 2.5. Thân lá già loài S. dielsiana………………………………………… 16 Hình 2.6. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC………………………………. 18 Hình 3.1. Sắc ký đồ tại độ pha loãng 50 lần…………………………………… 25 Hình 3.2 . Sắc ký đồ tại độ pha loãng 100 lần………………………………… 25 Hình 3.3. Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 1………………………… 26 Hình 3.4. Đường chuẩn xây dựng được từ dãy chuẩn 2………………………… 26 Hình 3.5. Đường chuẩn định lượng xây dựng được từ dãy chuẩn 3……………. 26 Hình 3.6. Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng…………… 28 Hình 3.7. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic……………………………. 29 Hình 3.8. Biểu đồ hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu của cây trồng từ hạt……………………………………………………………………… 34 Hình 3.9. Biểu đồ hàm lượng oxostephanin trung bình trong các mẫu của cây trồng từ hom……………………………………………………………………. 35 Hình 3.10. Biểu đồ so sánh hàm lượng oxostephanin theo mùa……………… 37 [...]... c a loài S dielsiana là rất lớn Hiện nay chúng tôi đã tiến hành trồng và theo dõi sự phát triển c a loài c y n y tại Ba Vì (Hà Nội) , với định hướng trồng phát triển một loài c y thu c mới theo hướng “Th c hành tốt trồng trọt và thu hái c y thu c (GACP)” c a tổ ch c Y Tế Thế Giới (WHO) Chính vì v y, nghiên c u hàm lượng oxostephanin tích l y trong c y, đ c biệt là đánh giá hàm lượng c a alkaloid n y. .. định lượng oxostephanin trong c y trồng loài S dielsiana Y C Wu bằng phương pháp HPTLC 2 Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong c y trồng loài S dielsiana Y C Wu 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y C WU 1.1.1 Đ c điểm th c vật và phân bố Loài S dielsiana Y C Wu thu c chi Stephania Lour., họ Tiết dê (Menisperaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculaceae), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae),... ở c c bộ phận kh c nhau c a c y c ý nghĩa quan trọng để x c định bộ phận thu hái, thời điểm thu hái phù hợp Hoạt động n y c ng là bư c đầu trong lộ trình tiêu chuẩn hóa dư c liệu Với c c lý do như trên, đề tài: Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong c y trồng loài Stephania dielsiana Y C Wu tại Ba Vì (Hà Nội) bằng phương pháp HPTLC đã đư c th c hiện với 2 m c tiêu sau: 2 1 X y dựng quy... oxostephanin trong c c mẫu thử + Đánh giá tính tuyến tính, độ đ c hiệu, độ thích hợp c a hệ thống, độ đúng c a phương pháp - Nghiên c u sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo c c bộ phận kh c nhau c a c y, theo độ tuổi, nguồn g c của c y và theo c c mùa trong năm 2.2.2 Phương pháp nghiên c u 2.2.2.1 X y dựng phương pháp định lượng - Xử lý mẫu thử: + Quy trình chiết xuất dư c liệu [4], [5], [8]: C n chính x c. .. lượng oxostephanin theo c c bộ phận kh c nhau c a c y, theo tuổi và theo nguồn g c c y, l y trên c ng một c y C c mẫu đư c thu 15 hái trên c c c y trồng từ hạt, trồng từ hom c a c y 1 tuổi, 2 tuổi, trưởng thành, thu hái c c bộ phận sau: + Mẫu c Hình 2.2 C loài S dielsiana + Mẫu thân lá non: phần ngọn c y, dài 50 – 60 cm, lá và thân c màu tím hồng Thân mềm nhẵn, kích thư c phát triển chưa đ y đủ Hình... Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần c a kết quả phân tích với giá trị th c của mẫu đã biết C ch tiến hành: Độ đúng c a phương pháp HPTLC đối với định lượng hoạt chất trong dư c liệu đư c x c định bằng phương pháp thêm chuẩn Chuẩn bị c c mẫu thử từ thân lá bánh tẻ c a c y trưởng thành trồng từ hạt, thân lá già c a c y trưởng thành trồng từ hạt, c c a c y trưởng thành trồng từ hạt theo quy trình như... là nư c có hệ th c vật phong phú, trong đó c khoảng 4000 loài th c vật c thể làm thu c trong c c nền Y h c dân gian, 800 loài thường đư c dùng trong Y H c cổ truyền chính thống và 300 loài dùng trong c ng nghiệp dư c [40] Như v y c thể th y tiềm năng về c y thu c ở Việt Nam c n rất lớn Nghiên c u để tìm ra c y thu c mới c ng những hoạt chất mới từ dư c liệu là vi c làm c n thiết để nâng cao giá trị... phân c c của c c thành phần trong dung dịch [1] - Rf là đại lượng đ c trưng cho m c độ di chuyển c a c c chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số n y đư c tính bằng tỷ lệ giữa khoảng c ch di chuyển c a chất phân tích và khoảng c ch dịch chuyển c a pha động: 7 Rf = Trong đó: dR: khoảng c ch từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm) dM: khoảng c ch từ điểm xuất phát đến m c dung môi pha động ( o trên... chọn ở trên Soi và chụp ảnh bản mỏng tại bư c sóng 366 nm, quan sát số lượng vết, hình dáng c c vết và so sánh giá trị RSD c a Rf [28] Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên giá trị RSD c a Rf C ng th c tính RSD: 21 Phương pháp HPTLC đư c coi là c tính đ c hiệu hay chọn l c đối với chất c n phân tích nếu: (i) S c ký đồ c a mẫu thử cho c c vết chính c c ng hình dạng, màu s c, giá trị Rf với c c vết chính... đư c lưu giữ ở phòng Tiêu bản – Trường Đại h c Dư c Hà Nội, mã số tiêu bản là HNIP/17701/1 0) trồng tại Xã Tản Lĩnh, Huyện Ba Vì, Hà Nội Hình 2.1 Vườn trồng c dòm tại xã Tản Lĩnh, Ba Vì, Hà Nội - Mẫu nghiên c u để x y dựng quy trình định lượng: Mẫu c và thân lá c y trồng loài S dielsiana trưởng thành, đư c thu hái nhiều lần tại c c thời điểm kh c nhau trong năm - Mẫu nghiên c u sự thay đổi hàm lượng . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI H C DƯ C HÀ NỘI NGUYỄN THỊ TH Y LINH ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG C Y TRỒNG LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. C. WU TẠI BA VÌ (HÀ NỘI) BẰNG PHƯƠNG. dõi sự phát triển c a loài c y n y tại Ba Vì (Hà Nội) , với định hướng trồng phát triển một loài c y thu c mới theo hướng “Th c hành tốt trồng trọt và thu hái c y thu c (GACP)” c a tổ ch c Y Tế. Giới (WHO). Chính vì v y, nghiên c u hàm lượng oxostephanin tích l y trong c y, đ c biệt là đánh giá hàm lượng c a alkaloid n y ở c c bộ phận kh c nhau c a c y c ý nghĩa quan trọng để x c định