LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới : TS. Phùng Thanh Hương Ths. Hà Thị Thu Những người Thày đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt, giúp đỡ và đặc biệt đã luôn truyền nhiệt huyết cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Xin chân thành cảm ơn các Thày, Cô giáo, các chị kỹ thuật viên - bộ môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành đề tài. Xin cảm ơn các anh, chị đang công tác tại Phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn luôn là động lực, là nguồn cổ vũ, động viên giúp em hoàn thành chương trình đại học và khóa luận tốt nghiệp. Sinh viên Phạm Việt Cường MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Chương 1. TỔNG QUAN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.1.Tổng quan về vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN) . . . . . . . . . . . 3 1.1.1.Cấu trúc ITS-rADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.1.2.Vai trò của ITS-rADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 1.1.3.Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 1.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc trên thế giới và ở Việt Nam 8 1.2.1.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc trên thế giới . . . . . . . . . . . . . . 8 1.2.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3.Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.3.1.Giới thiệu về họ Cam (Rutaceae) và chi Xuyên tiêu (Zanthoxylum). . . . . . . . . 10 1.3.2.Loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.3.3.Tình hình nghiên cứu và sử dụng loài Muồng truổng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.2.Hóa chất, sinh phẩm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 2.1.3.Trang thiết bị . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2.Phương pháp nghiên cứu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2.1.Phương pháp tách chiết ADN tổng số . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2.2.Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.2.3.Phương pháp điện di ADN trên gel agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.2.4.Phương pháp tách dòng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 2.2.5.Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli . . . . . . . . . . . 22 2.2.6.Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.2.7.Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 2.2.8.Phương pháp tinh sạch ADN plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 2.2.9.Phương pháp giải trình tự ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.2.10.Phương pháp so sánh trình tự ADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3.1.Kết quả tách chiết ADN tổng số từ lá cây Muồng truổng …………………….……28 3.2.Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.3.Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.4.Kết quả tinh sạch plasmid tái tổ hợp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 3.5. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng . . . . . . . . . 33 3.6.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.6.1.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng.35 3.6.2.Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng với 2 trình tự của chi Zanthoxylum được công bố trên ngân hàng gen thế giới . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 3.6.3.Kết quả cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng. . . . . . . . 38 Chương 4. BÀN LUẬN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN của loài Muồng truổng. . . . . . . . 40 4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . . 41 KẾT LUẬN. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 ĐỀ XUẤT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin ADN Acid deoxyribonucleic rADN ADN mã hóa cho ARN ribosom AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ATCC American Type Culture Collection bp Base pair DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO Dimethylsulfoxid dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetra acetic Acid EtBr Ethidium Bromid HA22T Tế bào ung thư biểu mô gan IGS Intergenic spacer IPTG Isopropyl β-D-1- thiogalactopyranosid ISSR Inter-Simple Sequence Repeat ITS Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã nội) ITS-rADN Internal Transcribed Spacer – ribosomal AND (Trình tự ADN ribosom đoạn ITS) K-562 Tế bào ung thư bạch cầu ở người KHTN Khoa học tự nhiên LB Luria-Bertani OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PP2A Protein phosphatase 2A RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SAMPL Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci SDS Sodium Dodecyl Sulphat TAE Tris - Acetic acid – EDTA Taq Thermus aquaticus X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của một số loài thực vật hạt kín. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu hái 5 mẫu Muồng truổng . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Bảng 2.2. Cặp mồi dùng trong phản ứng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng tạo vertor tái tổ hợp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng giải trình tự gen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng đọc trình tự . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số . . . . . . . . . . . . 29 Bảng 3.2. Tỉ lệ %(G+C) vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng . . . . . . . . . . 35 Bảng 3.3. Hệ số tương đồngtrình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng37 Bảng 3.4. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu ZA1-ZA5 và mẫu ZAK, ZSK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc tổng thể của vùng ADN ribosom trong thực vật . . . . . . . . . . . . 3 Hình 1.2. Cầu trúc của vùng phiên mã nội ITS-rADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Hình 1.3. Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) . . . . . . . . . . . . . . . 12 Hình 2.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 Hình 3.2. Sản phẩm PCR của 5 mẫu Muồng truổng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 Hình 3.3. Ảnh điện di thể hiện plasmid tách từ tế bào E.coli sau khi biến nạp của các mẫu ZA1 và ZA2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 Hình 3.4. Ảnh điện di thể hiện plasmid tách từ tế bào E.coli sau khi biến nạp của các mẫu ZA3, ZA4, ZA5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 Hình 3.5. Sản phẩm cắt plasmid bằng enzym giới hạn EcoRI . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Hình 3.6. Sản phẩm tinh sạch plasmid mang gen ITS-rADN. . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 Hình 3.7. Trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng. . . . . . 35 Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 Hình 3.9. Cây phân loại 5 mẫu Muồng truổng dựa trên so sánh trình tự ITS-rADN 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam được đánh giá là quốc gia có nguồn cây thuốc tự nhiên phong phú và đa dạng về chủng loại lẫn công dụng làm thuốc. Tuy nhiên hiện nay chỉ có khoảng 5% số loài có công dụng làm thuốc được giới thiệu và đưa vào khai thác, số loài chưa được nghiên cứu và đánh giá hiện còn rất lớn [3]. Cùng với đó nhu cầu sử dụng cây thuốc hàng năm trong nước ngày càng tăng, trong khi nguồn cây thuốc tự nhiên lại chưa được quản lý khai thác chặt chẽ dẫn đến cạn kiệt về số lượng và mất dần tính đa dạng. Trong bối cảnh như vậy cần nhanh chóng thực hiện những biện pháp nhằm bảo vệ, sử dụng và phát triển nguồn cây thuốc một cách hợp lý. Trong số những biện pháp cần thiết hiện nay, đánh giá đa dạng di truyền nguồn cây thuốc có vai trò đặc biệt quan trọng. Việc làm này có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu, khai thác và sử dụng nguồn cây thuốc, như: xây dựng và bảo tồn nguồn gen; chọn tạo giống cho năng suất cao, chất lượng tốt; xác định nguồn gốc, quan hệ tiến hóa; nhận diện dược liệu một cách chính xác. Ngoài ra những dữ liệu về cấu trúc gen của các quần thể cây thuốc còn cần thiết cho chiến lược khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên cây thuốc [14], [30]. Để đánh giá đa dạng di truyền cây thuốc, hiện nay trên thế giới có nhiều loại chỉ thị ADN và marker phân tử được sử dụng như RAPD-PCR, AFLP, ITS-rADN, ADN lạp thể… Trong số đó trình tự vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN) được biết đến là marker phân tử có nhiều ưu điểm nổi trội trong đánh giá đa dạng di truyền như tính chất vừa bảo thủ, vừa siêu biến có thể giúp xác định nguồn gốc và quan hệ tiến hóa giữa các loài hoặc giữa các cá thể trong cùng một loài, hay có độ lặp lại cao trong ADN nhân giúp thực hiện các kĩ thuật khuếch đại, giải trình tự dễ dàng hơn [16], [40]. Mặc dù được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền thực vật trên thế giới nhưng trình tự vùng phiên mã nội của ADN ribosom lại hầu như chưa được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền cây thuốc ở Việt Nam. Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) là vị thuốc từ lâu đã được dân gian sử dụng để chữa bệnh mẩn ngứa, lở loét [10]. Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư, tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết từ cây Muồng truổng [21], [43]. Bên cạnh đó rễ, lá cây Muồng truổng chứa nhiều hợp chất thuộc các nhóm: alkaloid (chiếm phần lớn là berberin), terpenoid (tinh dầu), flavanoid và coumarin [5]. Có thể thấy Muồng truổng là cây thuốc có nhiều tiềm năng trong nghiên cứu sản xuất dược phẩm. Tuy nhiên ở nước ta hiện chưa có nhiều nghiên cứu về loài Muồng truổng, những nghiên cứu về Muồng truổng mới chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần hóa học. Do vậy cần đẩy mạnh nhiều nghiên cứu trên loài Muồng truổng hơn nữa, trong đó bao gồm các nghiên cứu về di truyền, bảo tồn gen. Xuất phát từ những lý do trên đề tài “Đánh giá đa dạng trình tự ADN ITS của loài Muồng truổng ở Việt Nam” được thực hiên với hai mục tiêu sau: 1. Xác định trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) thu hái ở các vùng khác nhau của Việt Nam. 2. So sánh trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 cá thể loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) ở Việt Nam với nhau và với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giới, qua đó đánh giá đa dạng di truyền loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) ở Việt Nam. Chương 1. TỔNG QUAN  Tổng quan về vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN)  Cấu trúc ITS-rADN Trong cả chuỗi ADN nhân của tế bào thực vật, khu vực được nghiên cứu nhiều nhất là vùng ADN ribosom 18S-26S và hai vùng phiên mã nội (ITS1, ITS2) với nhiều đoạn lặp về trình tự nucleotid [15]. Dưới đây là sơ đồ thể hiện cấu trúc tổng thể của ADN ribosom . Hình 1.1. Cấu trúc tổng thể của vùng ADN ribosom trong thực vật [33]  Vị trí của ADN ribosom trên nhiễm sắc thể.  Các đoạn gen (18S-5,8S-26S) xếp liên tiếp nhau trên ADN ribosom. ADN ribosom gồm những đoạn gen (18S-5,8S-26S) được xếp liên tiếp nhau, chia cắt các đoạn gen này là 1 vùng liên kết IGS (intergenic spacer) có kích thước thay đổi trong các quần thể khác nhau, có khi là giữa các cá thể [33]. Trong đoạn gen (18S-5,8S-26S) vùng ITS nằm giữa đơn vị 18S và 26S. Vùng ITS có 3 phần: ITS1; 5,8S và ITS2, trong đó tiểu đơn vị 5,8S là vùng có trình tự bảo tồn tiến hóa cao. Vùng ITS được chứng minh là trình tự ADN mang những đặc tính hữu ích cho việc nghiên cứu phát sinh loài của thực vật hạt kín [16]. Hình 1.2. Cấu trúc của vùng phiên mã nội ITS-rADN [16] Trong một nghiên cứu thống kê cho thấy ở một số loài thực vật có hoa, kích thước của vùng ITS1 và ITS2 thường nhỏ hơn 300bp (ITS1: 187-298 bp; ITS2: 187-252 bp), ngược lại, ở một số sinh vật nhân thật khác kích thước của 2 vùng này có thể lớn hơn nhiều, ví dụ như các loài động vật có xương sống. Vùng tiểu phân 5,8S có kích thước không đổi là 163-164 bp. Ở thực vật, kích thước của toàn bộ vùng ITS xấp xỉ 500-750 bp ở thực vật hạt kín và xấp xỉ 1500- 3700 bp ở thực vật hạt trần. Ví dụ: một nghiên cứu cho thấy kích thước vùng ITS của chi Phyllanthus dao động trong từ 571-597 bp, loài Breynia fruticosa có kích thước vùng ITS là 608 bp và loài Euphorbia milii là 649 bp. Kích thước vùng ITS ở nấm xấp xỉ 600-800 bp [15], [16], [29]. Vùng ITS1 thường có kích thước lớn hơn vùng ITS2, ví dụ như ở một số loài sau: Adoxaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Canellaceae, Malvaceae, Onagraceae, Polemoniaceae. Ngược lại, ở một số loài vùng ITS2 có kích thước lớn hơn vùng ITS1 như: Betulaceae, Cucurbitaceae, Scrophulariaceae và Viscaceae. Ở loài Solanaceae, hai vùng này có kích thước gần như bằng nhau. Đối với những họ lớn như: Fabaceae, Poaceae và Rosaceae, vùng ITS1 có kích thước dài hơn hoặc ngắn hơn vùng ITS2. Vùng ITS1 và ITS2 khác nhau cả về kích thuớc và % (G+C). Sau đây là một ví dụ về kích thước và % (G+C) của 2 vùng ITS1 và ITS2 của một số loài [16]. Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của một số loài thực vật hạt kín [16] Nhóm ITS1 ITS2 Nhóm Kích thước (bp) %(G+C) Kích thước (bp) %(G+C) Adoxaceae, Viburnum, 28 loài 224-231 59-69 215-227 59-69 Betulaceae, Alnu, 3 loài 215-216 58-64 228-229 53-65 Canellaceae, Canella, 1 loài 272 63 209 63 Fabaceae, Galegeae, 31 loài 221-231 55-60 207-217 50-54 Poaceae, Pooideae,10 loài 217-223 55-64 213-221 59-67  Vai trò của ITS-rADN Giống như những sinh vật nhân thật khác, hệ gen thực vật bậc cao bao gồm ADN nhân và ADN ngoài nhân. ADN ngoài nhân gồm có ADN lạp thể và ADN ti thể. ADN ti thể do chỉ mang nguồn gốc từ “mẹ”, không đánh giá chính xác được bản chất di truyền nên rất ít được dùng trong nghiên cứu phát sinh loài. ADN lạp thể ở thực vật có tính bảo thủ cao và có tần số đột biến thấp do đó được dùng làm căn cứ tìm hiểu nguồn gốc của các loài và trên loài. Tuy nhiên để tìm hiểu nguồn gốc các bậc phân loại thấp hơn ADN nhân tỏ ra có nhiều ưu thế bởi ADN nhân có mức độ tiến hóa nhanh hơn, cho phép phân tích được sự khác biệt về di truyền giữa các loài trong cùng một chi hay giữa các cá thể của cùng một loài. Bên cạnh đó có nhiều bằng chứng đã chứng minh khi tái hiện cấu trúc các loài có quan hệ di truyền việc sử dụng ADN ngoài nhân có thể làm sai lệch lớn đến sự phân loại [15], [17]. Vùng phiên mã nội của ADN ribosom (ITS-rADN) là vùng gen vừa mang tính bảo thủ (đoạn 5,8S) vừa mang tính siêu biến (vùng ITS1 và ITS2) do đó có khả năng phản ánh quan hệ tiến hóa cũng như đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ chi, loài và dưới loài. Trái lại, trình tự nucleotid của vùng 18S và của ADN lạp thể có mức độ bảo thủ quá cao nên không đủ chi tiết để phân định giữa các cá thể trong cùng một loài [16], [40]. Song song với đặc tính hữu ích nói trên, trình tự vùng phiên mã nội của ADN ribosom còn có một số ưu điểm nổi bật khẳng định ưu thế trong nghiên cứu phát sinh loài và đánh giá đa dạng di truyền của thực vật hạt kín, đó là: thứ nhất, vùng ITS mang đặc tính di truyền của cả “bố” và “mẹ”, khác với các marker ADN lạp thể hay ADN ti thể chỉ mang đặc tính di truyền của [...]... Tách chiết ADN tổng số ADN tổng số Gen ITS- rADN Điện di agarose Khuếch đại gen ITS- rADN Gắn gen ITS- rADN vào plsamid pCR 2.1 Biến nạp ADN plasmid vào E.coli Chọn dòng mang plasmid pCR2.1 ITS- rADN Điện di agarose Tách chiết ADN plasmid Điện di agarose Cắt plasmid bằng enzym EcoRI Điện di agarose Tinh sạch ADN plasmid Giải trình tự gen ITS- rADN So sánh, đánh giá đa dạng trình tự gen ITS- rADN Hình 2.1... nay trên thế giới và ở Việt Nam, chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền loài Muồng truổng được công bố Tuy nhiên kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen thế giới cho thấy đã có những nghiên cứu công bố trình tự nucleotid ADN lạp thể và vùng phiên mã nội rADN của loài Muồng truổng Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc so sánh và thực hiện đánh giá sự đa dạng di truyền loài Muồng truổng Chương... quá trình hình thành loài, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự ADN, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa loài, đánh giá đa dạng di truyền trong phạm vi một bậc phân loại [14], [33]  Ứng dụng của ITS- rADN trong nghiên cứu cây thuốc Với những ưu điểm nổi trội nêu trên, giá trị dữ liệu về trình tự vùng ITS được sử dụng phổ biển trong các nghiên cứu phát sinh loài, đánh giá đa dạng. .. cứu đa dạng di truyền cây thuốc ở Việt Nam Vấn đề nghiên cứu về hệ gen thực vật ở Việt Nam hầu hết mới chỉ phát triển trong lĩnh vực nông nghiệp với việc xác định trình tự gen, phân loại hệ thống và đánh giá đa dạng di truyền của các cây lương thực cơ bản như lúa, ngô, đậu,… và một số loài cây khác như: Xoài, Cao su, Điều, Lan rừng… Một số nghiên cứu khác tập trung đánh giá đa dạng di truyền những loài. .. học Quốc gia Hà Nội) đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử RAPD-PCR và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth), loài cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu ở Việt Nam [12] Phần lớn các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây thuốc sử dụng chỉ thị phân tử ADN đã tiến hành ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá sự đa dạng di truyền của sản phẩm PCR với... Mông cổ Tiến hành xác định trình tự vùng ITS1 để đánh giá đa dạng di truyền trong chi Ephedra đã xác định được nguốn gốc lai giữa các loài và phân loại 8 loài Ephedra được tìm thấy [26]  Một nghiên cứu khác sử dụng trình tự vùng ITS để đánh giá đa dạng di truyền và nghiên cứu sự phát sinh loài được thực hiện trên 27 mẫu thuộc chi Salvia ở Trung Quốc Chi Salvia có nhiều loài làm dược liệu với nhiều... đoạn ADN cần giải trình tự  Tiến hành: Trình tự ADN được xác định trên máy xác định trình tự ADN tự động ABI prism 3100 Sequencer (Applied Biosystems) với bộ kit xác định trình tự BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing kit của hãng Applied Biosystems Quy trình xác định trình tự được tiến hành theo 3 bước:  Bước 1: Thực hiện phản ứng tổng hợp : + Thành phần: Bảng 2.7 Thành phần phản ứng giải trình. .. nguyệt, hen suyễn Từ các trình tự vùng ITS, tác giả đã thiết lập được “cây phát sinh loài cùng với phương pháp phân loại theo hình thái, tìm ra các vị trí phát sinh loài Kết quả cũng cho thấy các loài Salvia tự nhiên có thể có nguồn gốc từ các loài nước ngoài du nhập [39]  Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc trên thế giới và ở Việt Nam  Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền cây thuốc... dược liệu bản địa ở Việt Nam [7] Hoàng Văn Lâm, Trần Văn Ơn (2008) (Đại học Dược Hà Nội) đã bước đầu đánh giá tính đa dạng di truyền của của chi Gynostemma ở Cao Bằng dựa trên chỉ thị RAPD-PCR [8] Đặng Ngọc Hoa (2011) (Đại học KHTN – Đại học Quốc gia Hà Nội) bước đầu nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các quần thể loài cây thuốc sa nhân tím (Amomum longiligulare T L Wu) ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD-PCR... chính xác Không chỉ dừng lại ở đó, chỉ thị phân tử còn cho phép xác định rõ nguồn gốc và quan hệ tiến hóa ở mức độ loài và dưới loài Tuy vậy để có thể đánh giá chính xác nhất sự đa dạng di truyền cây thuốc cần kết hợp các phương pháp trên [30] Có thể lấy một số ví dụ về đánh giá đa dạng di truyền cây thuốc đã được thực hiện trên thế giới như sau: Nghiên cứu đa dạng di truyền của một số cây thuốc thuộc . . . . . . . . . 40 4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS- rADN của loài Muồng truổng. . . . . . . . 40 4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam . . . . . . . . . . . . trên loài Muồng truổng hơn nữa, trong đó bao gồm các nghiên cứu về di truyền, bảo tồn gen. Xuất phát từ những lý do trên đề tài Đánh giá đa dạng trình tự ADN ITS của loài Muồng truổng ở Việt. sánh trình tự vùng ITS- rADN giữa 5 cá thể loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) ở Việt Nam với nhau và với trình tự đã công bố trên ngân hàng gen thế giới, qua đó đánh giá đa dạng