BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ TÌNH CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG CÓC (Bufo sp., Bufonidae) VÀ TRỨNG ẾCH (Rana rugolusa., Ranidae) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ TÌNH CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG CÓC (Bufo sp., Bufonidae) VÀ TRỨNG ẾCH (Rana rugolusa., Ranidae) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Rư Nơi thực hiện : Bộ môn Hóa Sinh HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới thầy giáo, TS. Nguyễn Văn Rư – bộ môn Hoá Sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của anh Nguyễn Quốc Toản đã cùng tôi hoàn thành đề tài này, đặc biệt là sự giúp đỡ tạo điều kiện của các thầy cô, các chị kỹ thuật viên của bộ môn Hoá Sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Đào Tạo, các phòng ban, thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại nhà trường. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ của mình. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Lê Thị Tình MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẶC ĐIỂM VỀ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ 2 1.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ RNASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ 3 1.2.1. Một số nghiên cứu RNase từ trứng động vật lưỡng cư 3 1.2.2. Cấu trúc phân tử của RNase từ trứng động vật lưỡng cư 5 1.2.3. Cơ chế xúc tác của RNase từ trứng động vật lưỡng cư 6 1.2.4. Hoạt tính gây độc tế bào của RNase từ trứng ếch 8 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của RNase 9 1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ RNASE 12 1.3.1. Các phương pháp chiết tách enzym RNase 12 1.3.2. Các phương pháp xác định hoạt độ của RNase 14 1.4. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA RNASE 14 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 16 2.1.1. Nguyên liệu 16 2.1.2. Hoá chất 16 2.1.3. Thiết bị 16 2.2.2. Kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein - enzym 17 2.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein 19 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ RNase 22 3.1. KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH RNASE TỪ TRỨNG ẾCH VÀ TRỨNG CÓC 24 3.1.1. Chiết RNase từ trứng ếch 24 3.1.3. Chiết RNase từ trứng cóc 24 3.1.4. Nhận các phân đoạn protein từ dịch chiết mô trứng cóc bằng kỹ thuật tủa phân đoạn với (NH 4 ) 2 SO 4 25 3.3.1. Kết quả xác định sự phân bố hoạt độ RNase từ trứng ếch 26 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 Kết luận 35 Đề xuất 35 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Axid Deoxiribonucleic ARN Axid ribonucleic Amph Amphinase BS – RNase Bovine seminal ribonuclease C pr Nồng độ protein DC Dịch chiết dd Dung dịch đvE Đơn vị enzym HđR Hoạt độ enzym Ribonuclease HđR riêng Hoạt độ riêng của enzym Ribonuclease MW Khối lượng phân tử OD Mật độ quang học ONC Onconase PCR Polymerase Chain Reaction PBS Phosphate buffered saline pH opt pH tối ưu Phđ Phân đoạn Pr Protein RNase Ribonuclease TC Trứng cóc TE Trứng ếch TT Thuốc thử TTHĐ Trung tâm hoạt động DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tỷ lệ pha các dung dịch để xây dựng đường chuẩn protein……………19 Bảng 2.2 Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết nồng độ…… …….21 Bảng 3.1 Hàm lượng protein từ các phân đoạn dịch chiết trứng ếch…………….25 Bảng 3.2 Hàm lượng protein từ các phân đoạn dịch chiết trứng cóc…………….26 Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết protein nhận được từ DCTE a ……………………………………………………… … 27 Bảng 3.4 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết protein nhận được từ DCTE b ……………………………………………………………28 Bảng 3.5 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết protein nhận được từ DCTC a …………………………………………………… 29 Bảng 3.6 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết protein nhận được từ DCTC b ……………………………………………… ………… 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Trứng động vật lưỡng cư … ………………………………… 2 Hình 1.2 Cấu trúc không gian của RNase A … ……………………… 5 Hình 1.3 Ảnh chụp 2AAS-NMR 3D của RNase ………………………… 6 Hình 1.4 Cơ chế phản ứng thuỷ phân RNA của RNase theo 2 giai đoạn [17]………………………………………………………………………….7 Hình 1.5 Cơ chế xúc tác kiềm – acid có sự tham gia của His – 12 và His – 119 [26]………………………………………………………………………… 7 Hình 1.6 Hoạt tính cytotoxin của RNase [26]……………………………… 8 Hình 1.7 Cấu trúc ba chiều của RI (màu đỏ) và RNase A (màu xanh) [2611 Hình 2.1 Sơ đồ các giai đoạn chiết tách RNase từ trứng ếch và trứng cóc 18 Hình 2.2 Đồ thị tương quan giữa nồng độ protein và độ hấp thụ quang………………………………………………………………….….21 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Năm 2012, có 8,2 triệu người trên thế giới chết vì ung thư. Với chi phí điều trị cao, hiệu quả điều trị thấp, ung thư trở thành gánh nặng cho bệnh nhân, gia đình và xã hội. Sự phát triển không ngừng của khoa học đã đem đến cho nhân loại những thành tựu vượt bậc, giúp chất lượng cuộc sống ngày một nâng cao. Trong lĩnh vực điều trị ung thư – căn bệnh vốn được coi là nan y – cũng đang có những bước đột phá đem lại cho người bệnh những hy vọng mới. Gần đây, các nhà nghiên cứu thuộc trường Đại học Bath và tổng công ty Alfacell đã phân lập thành công enzym Onconase và Amphinase thuộc nhóm Ribonuclease từ tế bào trứng ếch (loài Rana pipiens). Các enzym này đã và đang được tiến hành thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng trong điều trị ung thư đặc biệt là ung thư não. Tại Việt Nam, một số bài thuốc Đông y dùng cóc để chữa bệnh ung thư [1]. Trong khi đó, cóc và ếch đều thuộc lớp động vật lưỡng cư sinh sống ở nhiều vùng trong cả nước tạo nên nguồn nguyên liệu dồi dào cho nghiên cứu enzym. Tuy nhiên, ở nước ta chưa có các nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử về Ribonuclease từ trứng ếch và trứng cóc. Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Chiết tách và xác định hoạt tính của Ribonuclease từ trứng cóc (Bufo sp., Bufonidae) và trứng ếch (Rana rugolusa., Ranidae)” với các mục đích sau: - Chiết tách được chế phẩm RNase từ trứng cóc (Bufo sp., Bufonidae) và trứng ếch (Rana rugolusa., Ranidae) có mức độ tinh sạch khác nhau. - Xác định được hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết của 2 loại trứng cóc và trứng ếch. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC ĐIỂM VỀ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ Ếch và cóc phân bố ở nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, chúng sinh sống ở nhiều vùng tạo nên nguồn nguyên liệu phong phú cho nghiên cứu. Trứng đóng vai trò quan trọng trong sinh sản, chứa bộ nhiễm sắc thể mang thông tin di truyền. Bởi vậy, trong tế bào trứng có nhiều loại enzym - protein tham gia vào các quá trình chuyển hóa, sao chép, phiên mã, dịch mã và tổng hợp protein duy trì bộ gen của loài. Enzym RNase từ tế bào trứng ếch được đặc biệt chú ý trong thời gian gần đây với hoạt tính gây độc tế bào (hoạt tính cytotoxin) đã được chiết tách và tiến hành các thử nghiệm hướng tới điều trị ung thư. Ếch và cóc thuộc lớp động vật lưỡng cư. Do đó, cấu tạo của trứng đều có các đặc điểm chung của lớp lưỡng cư gồm năm phần như hình vẽ sau: Hình 1.1 Trứng động vật lưỡng cư 1. Lớp vỏ nhầy 4. Nhân trứng 2. Màng Vitellin 5. Phôi 3. Chất lỏng Perivitellin 3 Lớp vỏ nhầy bảo vệ phôi khỏi tác động từ môi trường bên ngoài. Màng vitellin bao quanh trứng có bản chất protein. Không gian giữa màng vitellin và phôi được chứa đầy chất lỏng perivitellin. Nhân trứng nuôi dưỡng phôi. Tế bào trứng của động vật lưỡng cư có enzym RNase và nhiều loại enzym khác phục vụ cho chứa năng sinh sản và dinh dưỡng của trứng. 1.2. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VỀ RNASE TỪ TRỨNG ĐỘNG VẬT LƯỠNG CƯ RNase thuộc nhóm enzym thủy phân [9], có cơ chất đặc hiệu là ARN. Hiện nay, trên thế giới đã phát hiện hơn 100 thành viên thuộc siêu họ RNase A và 9 loại RNase ở người [19], [21], [22], [23], [38], [43], [45]. Các nhà khoa học đã phân lập được RNase từ tế bào trứng ếch (Rana pipiens) có hoạt tính gây độc tế bào [14], [17],[33]. 1.2.1. Một số nghiên cứu RNase từ trứng động vật lưỡng cư Từ những năm 1960 – 1970, RNase A, EC 3.1.27.5 trở thành mô hình mẫu trong các công trình nghiên cứu enzym học nhờ ưu thế về nguồn tiếp cận, khả năng tinh chế dễ dàng cũng như kích thước phân tử nhỏ ~14 kDa. RNase A là enzym đầu tiên được xác định trình tự acid amin và là enzym thứ ba được xác định cấu trúc sau Lysozyme và Carboxypeptidase A [17], [26], [37]. Onconase và Amphinase là hai RNase lưỡng cư đầu tiên được phân lập và xác định trình tự bởi tổng công ty Alfacell có hoạt tính gây độc tế bào[51]. Onconase (ONC) còn gọi là Ranpirnase được chiết tách từ tế bào trứng ếch loài Rana pipiens với hoạt tính gây độc tế bào (hoạt tính cytotoxin) [11], [27], [29], [44]. Onconase chủ yếu tấn công vào giai đoạn G1 ức chế chu kỳ tế bào [12]. Tổng công ty Alfacell đã tiến hành thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I Ranpirnase ở bệnh nhân u trung biểu mô ác tính và ung thư phổi không phải [...]... 1% 0,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0 (ml) dd đệm (ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1,0 CPr (mg/ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 1,0 0 4 4 4 4 4 4 TT (ml) Gornal 4 4 4 4 4 20 Lấy chính xác 0,3 ml DC thêm 0,7 ml đệm PBS pH 7,4 và 4ml thuốc thử Gornal vào ống nghiệm Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đo mật độ quang ở bước sóng 550nm, cuvet... TC-4b D 0,1 67 0,2 40 0,2 76 0,3 03 0,2 35 0,3 02 0,3 11 0,3 61 Pr (mg) 1 8,5 5 2 6,6 5 3 0,6 0 3 3,6 0 2 6,0 5 3 3,5 0 3 4,5 0 4 0,7 0 - Nhận xét: Hàm lượng protein thu được tăng dần theo mức độ (NH4)2SO4 bão hòa Trong đ , hàm lượng protein của các phân đoạn dịch chiết trong môi trường acid H2SO4 0,2 5N thấp hơn trong môi trường PBS pH 7,4 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ RNASE TỪ TRỨNG ẾCH VÀ TRỨNG CÓC 3.3.1 Kết quả xác định sự... NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ CHIẾT TÁCH RNASE TỪ TRỨNG ẾCH VÀ TRỨNG CÓC 3.1.1 Chiết RNase từ trứng ếch - Mục đích: Chuyển enzym từ trong tế bào trứng ếch vào các dung dịch đệm PBS pH 7,4 và dung dịch H2SO4 0,2 5N - Kết quả: Thu được 74 ml DCmôTEa và 76 ml DCmôTEb từ trứng ếch - Nhận xét: Dịch chiết thu được từ môi trường acid H2SO4 0,2 5N trong hơn dịch chiết thu được từ môi trường PBS pH 7,4 ... Sau khi đo quang phổ hấp thụ của các dung dịch thu được kết quả sau 21 Bảng 2.2 Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết nồng độ 1,0 2,0 D 0,0 6 0,1 00 0,1 47 0,1 86 0,2 25 0,2 57 0,2 90 0,3 29 0,3 62 0,4 10 K 1 6,6 7 2 0,0 0 2 0,4 1 2 1,5 1 2 2,2 2 2 3,3 5 2 4,1 4 2 4,3 2 2 4,8 6 2 4,3 9 Cpr 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 1 0,0 (mg/ml) y = 0.0378x + 0.0287 R² = 0.9979 0.45 OD 550 0.4 Mật độ quang 0.35 0.3 0.25 OD 0.2 0.15... dịch chiết bằng phương pháp Biuret (kỹ thuật Gornal) - Mục đích: Xác định phân đoạn dịch chiết cho hàm lượng protein cao nhất và sử dụng để tính toán hoạt độ riêng của enzym  Hàm lượng protein từ trứng ếch Bảng 3.1 Hàm lượng protein từ các phân đoạn dịch chiết trứng ếch Pđ Pr TE-1a TE-2a TE-3a TE-4a TE-1b TE-2b TE-3b TE-4b D 0,1 55 0,1 83 0,1 97 0,2 05 0,0 95 0,1 54 0,2 08 0,2 30 Pr (mg) 1 7,2 0 2 0,0 3 2 1,8 5 2 2,7 5... trường acid Các phân đoạn dịch chiết trong hai môi trường dd H2SO4 0,2 5 N 29 và môi trường PBS đều có hoạt độ và hoạt độ riêng tăng dần theo sự tăng nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa 3.3.2.Kết quả xác định sự phân bố hoạt tính RNase từ trứng cóc - Mục đích: Xác định RNase có trong tế bào trứng cóc (Bufo sp. , Bufonidae) Kết quả xác định hoạt độ RNase trong 4 phân đoạn protein thu được từ hai loại DCTC được tóm tắt... Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết protein nhận được từ DCTCa HđR,% Phđ V, ml Pr, mg HđR theo các phđ HđRriêng, U/mg TC-1a 5 1 8,8 5 730 2 5,3 9 2 8,7 5 TC-2a 5 2 6,6 5 760 2 6,4 3 2 8,7 6 TC-3a 5 3 0,6 0 1105 3 8,4 3 3 6,1 1 TC-4a 5 3 3,6 0 280 9,7 5 8,3 3 - Nhận xét: HđR và HđRriêng ba phân đoạn đầu gần như nhau trong đó phân đoạn TC -3a cao nhất HđR và HđRriêng của TC-4a là thấp nhất, thấp... phân bố hoạt độ RNase từ trứng ếch - Mục đích: RNase động vật lưỡng cư mới chỉ được tìm thấy ở một số 27 loài Do đ , việc xác định hoạt độ của enzym cho phép sơ bộ khẳng định sự có mặt của RNase trong tế bào trứng ếch (Rana rogulosa ., Ranidae) ở Việt Nam Kết quả xác định hoạt độ RNase trong 4 phân đoạn protein thu được từ hai loại DCTE được tóm tắt trong các bảng sau Bảng 3.3 Kết quả xác định hoạt độ... phân đoạn dịch chiết protein nhận được từ DCTEa HđR% theo Pđ Pr V, ml Pr, mg HđR TE-1a 5 1 7,2 0 45 9,6 3 2,6 2 TE-2a 5 2 0,0 3 52 1 1,1 3 2,6 0 TE-3a 5 2 1,8 5 145 3 1,0 5 6,6 4 TE-4a 5 2 2,7 5 225 4 8,1 8 9,9 0 các phđ HđRriêng, U/mg - Nhận xét: HđR và HđRriêng tăng dần từ phân đoạn TE-1a đến TE- 4a Phân đoạn TE -1a và TE-2a có HđR và HđRriêng gần bằng nhau Phân đoạn TE-3a và phân đoạn TE- 4a cho HđR và HđRriêng cao... phân đoạn TE-1a và TE-2a Phân đoạn TE-4a cho HđR và HđRriêng cao nhất HđRriêng 28 tăng dần theo mức độ (NH4)2SO4 bão hòa Bảng 3.4 Kết quả xác định hoạt độ RNase trong các phân đoạn dịch chiết protein nhận được từ DCTEb HđR % Pđ Pr V, ml Pr, mg HđR theo các phđ HđRriêng, U/mg TE-1b 5 1 0,5 5 195 1 6,3 9 1 8,4 8 TE-2b 5 1 7,1 0 210 1 7,6 5 1 2,2 8 TE-3b 5 2 3,1 0 285 2 3,9 5 1 2,3 4 TE-4b 5 2 5,5 0 500 4 2,0 1 1 9,6 0 - Nhận xét: . tử về Ribonuclease từ trứng ếch và trứng cóc. Do đ , chúng tôi tiến hành đề tài: Chiết tách và xác định hoạt tính của Ribonuclease từ trứng cóc (Bufo sp. , Bufonidae) và trứng ếch (Rana rugolusa .,. NỘI LÊ THỊ TÌNH CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG CÓC (Bufo sp. , Bufonidae) VÀ TRỨNG ẾCH (Rana rugolusa ., Ranidae) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC. LÊ THỊ TÌNH CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA RIBONUCLEASE TỪ TRỨNG CÓC (Bufo sp. , Bufonidae) VÀ TRỨNG ẾCH (Rana rugolusa ., Ranidae) KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC