NGUYỄN VĂN THẮNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM DOXORUBICIN GẮN PEG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 NGUYỄN VĂN THẮNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM DOXORUBICIN GẮN PEG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS Nguyễn Thị Lập 2. TS. Hà Phương Thư Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa sinh 2. Bộ môn Bào chế 3. Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: TS. Nguyễn Thị Lập Cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Những lúc gặp khó khăn, cô đã luôn động viên tôi và chỉ cho tôi hướng giải quyết vấn đề. Trong khoảng thời gian học tập, nghiên cứu dưới sự hướng dẫn của cô, tôi đã học được rất nhiều điều bổ ích và thực sự đó là những hành trang quý báu giúp tôi thêm vững bước trên con đường đi sắp tới của mình. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hà Phương Thư, phòng Nano Y Sinh, viện Khoa học vật liệu. Cô đã cho tôi những lời khuyên bổ ích, tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Lê Quang Huấn, ThS. Lê Thị Thùy Dương cùng các cán bộ công tác tại phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học, những người đã nhiệt tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành khóa luận. Tôi xin cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bào chế, Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa phân tích, Khoa hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ tôi. Chính bố mẹ là nguồn động lực lớn nhất giúp tôi hoàn thành được khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới những người bạn, đặc biệt là bạn Hồ Trọng Toàn, chị Nguyễn Thị Bích Trân đã sát cánh bên tôi, hỗ trợ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận. SV Nguyễn Văn Thắng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN3 1.1. Đại cương về liposom3 1.1.1. Khái niệm3 1.1.2. Thành phần cấu tạo của liposom3 1.1.3. Phân loại4 1.1.4. Các phương pháp tạo liposom5 1.2. Doxorubicin và liposom doxorubicin6 1.2.1. Doxorubicin6 1.2.2. Liposom doxorubicin8 1.3. Số phận của liposom sau khi tiêm tĩnh mạch9 1.4. Những nỗ lực cải thiện thời gian tuần hoàn trong máu của liposom11 1.5. PEG và một số dẫn chất PEG-lipid ứng dụng trong chế tạo liposom12 1.6. Cơ chế PEG làm tăng thời gian tuần hoàn của liposom trong máu14 1.7. Các phương pháp tạo liposom gắn PEG16 1.7.1. Gắn PEG trong quá trình tạo liposom (phương pháp truyền thống, pre- modification)16 1.7.2. Gắn PEG sau quá trình tạo liposom (phương pháp post-modification)17 1.8. Ứng dụng của liposom gắn PEG18 1.8.1. Ứng dụng trong điều trị ung thư18 1.8.2. Ứng dụng trong điều trị một số bệnh lý khác 18 1.8.3. Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh19 1.8.4. Kết hợp để tối ưu hóa hệ mang thuốc liposom19 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU20 2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm20 2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất20 2.1.2. Thiết bị20 2.1.3. Động vật thí nghiệm21 2.2. Nội dung nghiên cứu21 2.3. Phương pháp nghiên cứu21 2.3.1. Phương pháp tạo liposom doxorubicin gắn PEG và liposom doxorubicin không gắn PEG21 2.3.2. Phương pháp đánh giá liposom tạo thành23 2.3.2.1. Phương pháp đánh giá kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân 23 2.3.2.2. Phương pháp xác định thế zeta24 2.3.2.3. Phương pháp định lượng doxorubicin24 2.3.2.4. Xác định hiệu suất liposom hóa doxorubicin25 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin 25 2.3.3.1. Chuẩn bị các điều kiện tiến hành thí nghiệm25 2.3.3.2. Tiêm chuột và lấy máu26 2.3.3.3. Phương pháp chiết doxorubicin toàn phần trong huyết tương26 2.3.3.4. Phương pháp định lượng doxorubicin trong huyết tương28 2.3.3.5. Tính giá trị AUC 0-24h của các dạng thuốc của doxorubicin29 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu29 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN30 3.1. Kết quả30 3.1.1. Chế tạo liposom doxorubicin gắn PEG30 3.1.2. Đánh giá liposom gắn PEG tạo thành30 3.1.2.1. Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân 30 3.1.2.2. Thế zeta32 3.1.2.3. Hiệu suất liposom hóa doxorubicin 32 3.1.3. Bước đầu tìm hiểu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom 35 3.1.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn doxorubicin trong huyết tương35 3.1.3.2. Khảo sát nồng độ doxorubicin trong huyết tương36 3.2. Bàn luận39 3.2.1. Về quy trình tạo liposom doxorubicin gắn PEG39 3.2.1.1. Lựa chọn nguyên liệu và công thức39 3.2.1.2. Quy trình chế tạo liposom doxorubicin gắn PEG và các chỉ tiêu chất lượng của chế phẩm tạo thành 39 3.2.2. Về quy trình chiết doxorubicin trong huyết tương42 3.2.3. Về ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn của liposom trong máu42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ ADN Acid deoxyribonucleic AUC Area under the curve (Diện tích dưới đường cong) Chol Cholesterol DLS Dynamic Light Scattering (Tán xạ ánh sáng động) DOX Doxorubicin DMPC 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin DSPE-PEG-NH 2 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- [amino(polyethylen glycol)] ECG Electro-Cardio Gram (Điện tâm đồ) MPEG Monomethoxy polyethylen glycol mPEG-DSPE 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- [methoxy(polyethylen glycol)] MPS Mononuclear Phagocytic System (Hệ thực bào đơn nhân) PDI Polydispersity Index (Chỉ số đa phân tán) PEG Polyethylen glycol PHEPC Partially hydrogenated egg phosphatidylcholine (Phosphatidyl cholin trứng hydro hóa một phần) T 1/2 Thời gian bán thải TMPEG Tresylat monomethoxy polyethylen glycol tt/tt Thể tích/thể tích US-FDA Cục Quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại liposom theo kích thước và số lớp4 Bảng 2.1. Nguyên liệu tạo liposom gắn PEG và liposom không gắn PEG21 Bảng 3.1. Kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân của các mẫu liposom gắn PEG và liposom không gắn PEG31 Bảng 3.2. Thế zeta và độ di chuyển của các mẫu liposom gắn PEG và liposom không gắn PEG32 Bảng 3.3. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ của doxorubicin hydroclorid trong môi trường NaCl 0,9% và Triton X-100 1% (tt/tt).33 Bảng 3.4. Hiệu suất liposom hóa doxorubicin của mẫu liposom gắn PEG và liposom không gắn PEG34 Bảng 3.5. Sự phụ thuộc của mật độ huỳnh quang vào nồng độ dung dịch doxorubicin hydroclorid35 Bảng 3.6. Nồng độ tương đương doxorubicin trong huyết tương chuột nhắt tại các thời điểm 5 phút, 4 giờ, 24 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch đuôi 37 Bảng 3.7. Giá trị AUC 0-24h của các dạng thuốc doxorubicin trên chuột nhắt (tiêm tĩnh mạch đuôi, liều 10 mg/kg) 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo của doxorubicin6 Hình 1.2. Các giai đoạn sinh lý trong sự thải trừ của liposom9 Hình 1.3. Công thức cấu tạo của polyethylen glycol12 Hình 1.4. Một số dẫn chất lipid của polyethylen glycol13 Hình 1.5. Cơ chế PEG kéo dài thời gian tuần hoàn của liposom trong máu 15 Hình 1.6. Các phương pháp tạo liposom gắn PEG16 Hình 2.1. Quy trình chiết doxorubicin toàn phần từ huyết tương27 Hình 3.1. Đồ thị thể hiện sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ doxorubicin hydroclorid trong môi trường NaCl 0,9% và Triton X-100 1%33 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn tương quan giữa mật độ huỳnh quang và nồng độ doxorubicin hydroclorid36 Hình 3.3. Nồng độ tương đương doxorubicin trong huyết tương chuột nhắt tại thời điểm 5 phút, 4 giờ, 24 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch đuôi37 ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ khi được phát hiện vào những năm 1960 bởi Bangham, liposom đã được nghiên cứu rộng rãi và ứng dụng làm hệ mang nhiều thuốc khác nhau. Ưu điểm của liposom là tính tương hợp sinh học và khả năng mang được cả các thuốc tan trong nước và không tan trong nước khác nhau như thuốc điều trị ung thư, các kháng sinh, kháng sinh chống nấm, glucocorticoid…Tuy nhiên, một trong những nhược điểm lớn nhất của liposom khi sử dụng đường tiêm chính là bị thải trừ nhanh chóng khỏi vòng tuần hoàn do sự tóm bắt của các tế bào thuộc hệ thực bào đơn nhân (MPS) [13],[30]. Một trong những biện pháp hiệu quả để khắc phục nhược điểm này là gắn lên bề mặt liposom các polyme thân nước, phổ biến là polyethylen glycol (PEG) với khối lượng phân tử từ 1000 đến 5000 Da [11],[13]. Sự tăng thời gian tuần hoàn của liposom gắn PEG mang lại nhiều lợi ích: giảm sự rò rỉ thuốc trong tuần hoàn, giảm các tác dụng không mong muốn của thuốc, làm tăng cơ hội thoát mạch vào khoảng gian bào của liposom, tăng sự tích lũy của các thuốc chống ung thư tại khối u và tăng hiệu quả điều trị [23],[30],[43],[55]. Những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành ở trường Đại học Dược Hà Nội nhằm đánh giá khả năng ứng dụng liposom làm chất mang thuốc. Trong đó, liposom doxorubicin được nghiên cứu nhiều nhất và đã đạt được nhiều kết quả đáng khích lệ. Các nghiên cứu đã bước đầu đưa ra được quy trình sản xuất thuốc tiêm liposom doxorubicin với hiệu suất liposom hóa doxorubicin lớn hơn 80%. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chế tạo liposom từ nguyên liệu là phospholipid và cholesterol, chưa có nghiên cứu nào sử dụng các dẫn chất polyme để làm tăng thời gian tuần hoàn của liposom doxorubicin. Với mong muốn tạo ra các liposom doxorubicin có khả năng tuần hoàn kéo dài, góp phần cải thiện tính hiệu quả của hệ mang thuốc liposom, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Bước đầu nghiên cứu tạo liposom doxorubicin gắn PEG”. Đề tài gồm có hai mục tiêu chính: 1. Chế tạo và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của hỗn dịch liposom doxorubicin gắn PEG. 2. Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin. [...]... nhau của doxorubicin: dạng thuốc tự do, dạng liposom không gắn PEG và liposom gắn PEG 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp tạo liposom doxorubicin gắn PEG và liposom doxorubicin không gắn PEG Bảng 2.1 Nguyên liệu tạo liposom gắn và liposom không gắn PEG STT 1 Tên nguyên liệu Phospholipid trứng Liposom gắn PEG 231,25 mg Liposom không gắn PEG 250 mg 2 Cholesterol 62,82 mg 62,82 mg 3 DSPE -PEG2 000-NH2... cung cấp 2.2 Nội dung nghiên cứu - Chế tạo liposom doxorubicin gắn PEG và so sánh với liposom doxorubicin không gắn PEG về một số chỉ tiêu: + Kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân + Thế zeta + Hiệu suất tải thuốc - Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn của liposom doxorubicin trong máu thông qua việc khảo sát nồng độ doxorubicin tại một số... (TMPEG) trong dung dịch đệm phosphat (pH 8,5) Sau khi ủ 2 giờ ở 22oC, TMPEG không phản ứng (không gắn lên liposom) được loại đi bằng sắc ký lọc gel (Sepharose 4B) Các liposom gắn PEG tạo thành có thời gian thời gian bán thải dài hơn liposom không gắn PEG (thời gian bán thải của liposom gắn PEG là 10 giờ, liposom không gắn PEG là 7 giờ) Một kỹ thuật khác có thể sử dụng để gắn PEG lên bề mặt các liposom. .. Hai mẫu liposom doxorubicin không gắn PEG (liposom doxorubicin) và liposom doxorubicin gắn PEG (PEG -liposom doxorubicin) với các thành phần nguyên liệu ban đầu như trong bảng 2.1 được chế tạo với cùng một quy trình Quy trình chế tạo được xây dựng dựa trên sự tham khảo các nghiên cứu trước đó [1],[2],[15] và có một vài thay đổi để phù hợp với điều kiện thực tế, cụ thể gồm các bước như sau: Bước 1: Hydrat... Sự linh động này khiến lớp polyme khó thấm và tạo thành một lớp áo bao bọc và bảo vệ toàn bộ liposom, trong khi các polyme kém linh động như dextran không tạo ra được sự bảo vệ toàn diện trên bề mặt liposom [50] 1.7 Các phương pháp tạo liposom gắn PEG PEG có thể được gắn vào liposom trong hoặc sau quá trình tạo liposom 1.7.1 Gắn PEG trong quá trình tạo liposom (phương pháp truyền thống, premodification)... lipid của PEG, ví dụ mPEG-DSPE, cùng các lipid khác được hòa tan trong một pha dung môi hữu cơ và tiến hành hydrat hóa tạo liposom theo các phương pháp trình bày ở mục 1.4 PEG sẽ phân bố ở cả 2 bên màng lipid kép của liposom tạo thành (hình 1.6A) Hình 1.6 Các phương pháp tạo liposom gắn PEG [35] 1.7.2 Gắn PEG sau quá trình tạo liposom (phương pháp post-modification) Có 2 kỹ thuật chính để gắn PEG lên... tiểu phân của các mẫu liposom gắn PEG và liposom không gắn PEG Kích thước trung Mẫu liposom PDI Phân bố bình theo đường KTTP theo kính (nm) thể tích (%) Độ rộng pic (nm) Trước khi tải thuốc Liposom 0,074 108,9 100 34,98 PEG -liposom 0,081 100,6 100 33,12 0,110 135,8 100 51,53 0,179 124,9 100 70,18 Liposom sau khi tải thuốc Liposom doxorubicin PEG -liposom doxorubicin Nhận xét: - Với liposom trước khi tải... so với 58oC) và trong thời gian rất ngắn (5 phút) Sau khi quá trình gắn hoàn tất, mPEG-DSPE tồn tại ở dạng monome và được loại bằng cách sử dụng sắc ký lọc gel 1.8 Ứng dụng của liposom gắn PEG 1.8.1 Ứng dụng trong điều trị ung thư: Doxil® là chế phẩm liposom gắn PEG đầu tiên được US-FDA phê duyệt cho điều trị lâm sàng Một chế phẩm khác của liposom doxorubicin gắn PEG có mặt trên thị trường hiện nay... [49] (5) Liposom hướng đích hay liposom miễn dịch (immunoliposomes): là liposom được gắn thêm các ligand trên bề mặt, các ligand này có khả năng nhận biết, gắn vào tế bào đích tạo điều kiện cho liposom tích lũy tại đích [49] 1.1.4 Các phương pháp tạo liposom Có nhiều quy trình khác nhau để chế tạo liposom nhưng tựu chung lại đều trải qua các giai đoạn sau: Giai đoạn hydrat hóa hình thành liposom Ở... Loại liposom Ký hiệu 1 Liposom đơn lớp 2 Liposom đa lớp 3 Liposom nhiều túi Dựa vào thành phần và ứng dụng, liposom có thể được phân chia thành các loại: (1) Liposom truyền thống (conventional liposomes): liposom được tạo thành từ các phospholipid khác nhau, cholesterol và có thể có các lipid khác nhưng không có bất kỳ sự thay đổi nào trên bề mặt liposom [20] (2) Liposom nhạy cảm với pH (pH-sensitive liposomes): . NGUYỄN VĂN THẮNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM DOXORUBICIN GẮN PEG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 NGUYỄN VĂN THẮNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM DOXORUBICIN GẮN PEG KHÓA LUẬN. nghiệm21 2.2. Nội dung nghiên cứu2 1 2.3. Phương pháp nghiên cứu2 1 2.3.1. Phương pháp tạo liposom doxorubicin gắn PEG và liposom doxorubicin không gắn PEG2 1 2.3.2. Phương pháp đánh giá liposom tạo thành23 2.3.2.1 tiêu chất lượng của hỗn dịch liposom doxorubicin gắn PEG. 2. Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của gắn PEG lên bề mặt liposom tới thời gian tuần hoàn trong máu của liposom doxorubicin. CHƯƠNG I. TỔNG