BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HÀ BƯỚC ĐẦU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME LACCASE TRONG PHỨC HỆ NANO CHITOSAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HÀ BƯỚC ĐẦU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME LACCASE TRONG PHỨC HỆ NANO CHITOSAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Lê Quang Huấn 2. TS. Đỗ Hồng Quảng Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Hóa sinh 2. Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới : PGS.TS Lê Quang Huấn TS. Đỗ Hồng Quảng Những người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình, dìu dắt, giúp đỡ và đặc biệt đã luôn truyền nhiệt huyết cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới anh Phạm Văn Phúc, chị Nguyễn Hải Vân, Ths. Lê Thị Thuỳ Dương và các anh, chị đang công tác tại Phòng Công nghệ tế bào động vật và Phòng Công nghệ tái tạo môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện giúp em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo, các chị kỹ thuật viên - bộ môn Hóa sinh - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành đề tài. Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên, cổ vũ giúp em hoàn thành chương trình đại học và khóa luận tốt nghiệp. Sinh viên Nguyễn Ngọc Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Phần 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Laccase 3 1.1.1. Giới thiệu về Laccase 3 1.1.2. Nguồn thu laccase 3 1.1.3. Cấu trúc laccase 5 1.1.5. Đặc tính của laccase 9 1.1.6. Ứng dụng của laccase 10 1.1.7. Phương pháp xác định hoạt tính laccse 11 1.1.8. Các phương pháp tách chiết, tinh sạch enzyme 12 1.2. Chitosan và nano chitosan 14 1.2.1. Nguồn gốc và cấu trúc chitosan 14 1.2.2. Tính chất lý hoá của chitosan 14 1.2.3. Tính chất sinh học của chitosan 15 1.2.4. Tiểu phân nano chitosan 15 1.2.5. Các phương pháp chế tạo hạt nano chitosan 16 Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị 22 2.1.1. Vật liệu 22 2.1.2. Hoá chất 22 2.1.3. Thiết bị, máy móc 22 2.2. Nội dung nghiên cứu 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy nấm thu dịch enzyme 25 2.3.2. Phương pháp tinh sạch enzyme laccase 25 2.3.3. Phương pháp xác định tính chất enzyme laccase 26 2.3.4. Phương pháp tạo hạt nano chitosan 28 2.3.5. Phương pháp cố định enzyme laccase lên hạt nano chitosan 30 2.3.6. Phương pháp phân tích đặc điểm của nano chitosan 31 2.3.7. Phương pháp kiểm tra hiệu quả cố định enzyme laccase lên nano chitosan 31 Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1. Kết quả tách chiết, tinh sạch enzyme laccase 33 3.1.1. Nuôi cấy thu dịch enzyme 33 3.1.2 Tinh sạch protein bằng cột sắc ký lọc gel Sephadex G-75 33 3.1.3. Tinh sạch protein qua cột sắc ký trao đổi ion 35 3.2. Kết quả tạo phức hệ nano chitosan - enzyme laccase 37 3.2.1. Kết quả tạo tiểu phân nano chitosan 37 3.2.2. Kết quả cố định enzyme laccase lên tiểu phân nano chitosan 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethybenzthiazoline-6-sulphonic acid DMP Dimethylphenol DDT Dichloro diphenyl trichloroethane HAA 3-hydroxyanthranillic acid HBT 1-hydroxybenzo-trialzone HCH Hexachlorocyclohexane HPI N-hydroxyphtaimide PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCB Polychlorinated biphenyl PDA Potato dextrose agar SDS Sodium dodecyl sulfate TNT Trinitrotoluen VLA Violuric acid DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Nội dung Trang Bảng 2.1 Thành phần của một bảng gel polyacrylamid 28 Bảng 3.1 Tóm tắt quá trình tinh sạch laccase từ chủng Cerrena sp FBV25 34 Bảng 3.2 Kết quả do hoạt độ nano chitosan - laccase và laccase 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Nội dung Trang Hình 1.1 Cấu trúc không gian ba chiều của laccase 6 Hình 1.2 Trung tâm hoạt động của laccase 7 Hình 1.3 Cơ chế xúc tác của laccase 8 Hình 1.4 Phản ứng deacetyl hoá chitin tạo thành chitosan 15 Hình 1.5 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo liên kết ngang nhũ tương 18 Hình 1.6 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp giọt tụ 19 Hình 1.7 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương 20 Hình 1.8 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp tạo gel ion 21 Hình 1.9 Sơ đồ tạo hạt bằng phương pháp mixen đảo 22 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 25 Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng depolymer hoá chitosan phân tử lượng cao 30 Hình 3.1 Hàm lương protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi qua cột sắc ký lọc gel 35 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng Cerrena sp.FBV25 qua cột sắc ký lọc gel G-75 trên gel polyacrymide 36 Hình 3.3 Hàm lương protein và hoạt tính các phân đoạn sau khi qua cột trao đổi ion 37 Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch laccase từ chủng Cerrena sp.FBV25 trên gel polyacrymide 38 Hình 3.5 Hình ảnh SEM mẫu nano chitosan 39 Hình 3.6 Kết quả đo phân bố size nano chitosan 39 Hình 3.7 Kết quả đo thế zeta nano chitosan 40 Hình 3.8 Hình ản phản ứng màu của laccace với ABTS 42 ! 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Laccase là một polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxidase có bốn nguyên tử đồng trong phân tử. Laccse có khả năng xúc tác phản ứng oxy hoá của nhiều cơ chất khác nhau với chất nhận điện tử cuối cùng là oxy. Được tìm ra lần đầu tiên từ năm 1883 [15], enzyme laccase đã thu hút đ ược rất nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu trong thập kỉ qua bởi đặ c tính sinh học tự nhiên củ a nó. Trong công nghệ sinh học nano, laccase được ứng dụng như những chất cảm biến sinh học gắn với các tiểu phân nano dùng cho kiểm nghiệm miễn dịch, xác định glucose, amin thơm và các hợp chất phenolic [12, 26]. Đặc biệt, laccase cũng được báo cáo là có khả năng ức chế virus HIV-1 [14] và các dòng tế bào Hep G2 là dòng tế bào ung thư gan và MCF-7 là dòng tế bào ung thư vú [13]. Cùng với đó, các chất mang gắn thuốc với kích cỡ nano đang được nghiên cứu ứng dụng mạnh mẽ trong y học để chẩn đoán và điều trị bệnh, đặc biệt là với bệnh ung thư. Các hạt nano có kích cỡ rất nhỏ có thể đi qua các hàng rào sinh học của cơ thể, mang thuốc đến đúng tế bào bệnh giúp nâng cao hiệu quả điều trị. Hơn nữa, khi enzyme được cố định lên các hệ nano, các hạt nano còn có tác dụng bảo vệ hoạ t tính enzyme. Vì thế, tiềm năng ứng dụng của enzyme laccase cùng với công nghệ nano trong điều trị bệnh là rất lớn. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào báo cáo về việc cố định enzyme laccase lên các hạt nano. Chitosan là sản phẩm deacetyl hoá của chitin, thành phần chính của vỏ tôm cua. Chitosan có nhiều đặc tính sinh học của một chất mang gắn thuốc lý tưởng như tính hoà hợ p sinh học, tính phân huỷ sinh học, độc tính thấp, giá thành thấp [9, 38]. Các tiểu phân nano chitosan cũng thể hiện những tính chất lý tưởng cho việc cố định enzyme như từ tính, và diện tích bề mặt lớn, bảo vệ [...]... thu được enzyme laccase có độ tinh sạch cao, dùng để cố định lên nano chitosan − Chế tạo và đánh giá một số tính chất của tiểu phân nano chitosan − Bước đầu cố định enzyme laccase lên nano chitosan và đánh giá hiệu suất   3 Phần 1: TỔNG QUAN 1.1 Laccase 1.1.1 Giới thiệu về Laccase Laccase (p-benzenediol: oxygen oxidoreductase, E.C.1.10.3.2) là một polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxidase Trong phân...   2 enzyme khỏi sự phân huỷ hoá học, tránh sự xáo trộn các ion kim loại của enzyme Chính vì thế, chúng tôi lựa chọn chitosan để tiến hành nghiên cứu chất mang gắn enzyme laccase cho đề tài: "Bước đầu chế tạo và đánh giá hoạt tính enzyme laccase trong phức hệ nano chitosan" , với mục đích bước đầu nghiên cứu phát triển một loại thuốc chữa ung thư Đề tài gồm có ba mục tiêu chính: − Tinh sạch enzyme laccase. .. ABTS laccase thường hoạt động trong khoảng 27 - 300C [18], với cơ chất là DMP laccase hoạt động ở 25 - 300C [18] Nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thay đổi trong khoảng 25 800C, một vài loại enzyme có nhiệt độ hoạt động tối thích dưới 350C Nhiệt độ hoạt động tối thích của laccase từ P ostreatus nằm trong khoảng 25 350C [18] 1.1.6 Ứng dụng của laccase Phương pháp oxy hoá sinh học nhờ enzyme. .. hiện gen mã hoá laccase nhằm tạo ra một lượng enzyme đủ lớn với giá thành hạ đáp ứng nhu cầu ứng dụng của laccase trong các lĩnh vực công nghiệp Tuỳ vào hệ thống biểu hiện sử dụng, hoạt tính và các đặc tính của laccase tái tổ hợp không hoàn toàn giống với chủng gốc và không giống nhau   5 ngay cả khi cùng nguồn gen Các hệ thống vật chủ đã được sử dụng để biểu hiện thành công laccase từ nấm cho đến thời... năng giữ enzyme bằng những chất nền không hoà tan, được nhồi vào trong cột sắc ký   14 1.2 Chitosan và nano chitosan 1.2.1 Nguồn gốc và cấu trúc chitosan Chitosan là dẫn xuất deacetyl hoá của chitin, trong đó nhóm -NH2 thay thế nhóm -NHCOCH3 ở vị trí C2 của chitin Đơn vị cấu tạo phân tử chitosan là β-D-glucosamin bởi liên kết α-(1-4)-glycoside [3] Hình 1.4: Phản ứng deacetyl hoá chitin tạo thành chitosan. .. vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N- − Chitosan ở thể rắn tồn tại dưới 2 dạng: dạng tinh thể và dạng vô định   15 hình Chitosan không tan trong nước, kiềm đặc và loãng, không tan trong cồn, aceton và các dung môi hữu cơ khác Chitosan tan trong dung dịch acid loãng tạo dung dịch keo trong suốt Độ nhớt của chitosan trong dung dịch acid loãng liên quan đến kích thước và khối lượng phân... acid polyacrylic để điều khiển và kéo dài thời gian phóng thích thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc đến mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi; tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [25] 1.2.5 Các phương pháp chế tạo hạt nano chitosan Theo S.A Agnihotri (2004), có 5 phương pháp chủ yếu tạo hạt nano chitosan là: Phương pháp trùng... chung, thuốc điều trị tại đích là một giá mang nano (nanocarrier) cấu tạo đặc biệt giúp chuyển giao hoạt chất đến đích sinh học [1]   16 Tiểu phân nano chitosan là một loại tiểu phân nano polymer, các tiểu phân nano polymer được phát triển như một dạng bào chế cải tiến nhằm thay thế các liposome kém bền trong thử nghiệm in vivo cũng như trong thời gian bảo quản [1] Nano chitosan có kích thước siêu nhỏ (10-1000nm)... guanial và syringaldazine, giá trị pH tối ưu cho hoạt động của enzyme cao hơn, từ 4.0 - 7.0 Độ bền pH của các laccase khác nhau khá nhiều, đa phần các laccase   10 bền ở pH 6 Độ bền pH của laccase từ T versicolor nằm trong dải pH từ 2.5 7 sau một giờ ủ còn trên 50% [1] Khoảng nhiệt độ hoạt động tối thích của các laccase thường trong khoảng 25 - 300C tuỳ vào từng loại cơ chất xúc tác và các loại laccase. .. tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa Thay vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho các giọt chitosan kết hợp với các giọt NaOH Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo ra trong parafin lỏng Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên Khi cả hai hệ nhũ tương này được trộn . nghiên cứu chất mang gắn enzyme laccase cho đề tài: " ;Bước đầu chế tạo và đánh giá hoạt tính enzyme laccase trong phức hệ nano chitosan& quot;, với mục đích bước đầu nghiên cứu phát triển. sạch enzyme laccase để thu được enzyme laccase có độ tinh sạch cao, dùng để cố định lên nano chitosan. − Chế tạo và đánh giá một số tính chất của tiểu phân nano chitosan. − Bước đầu cố định enzyme. ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HÀ BƯỚC ĐẦU CHẾ TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ENZYME LACCASE TRONG PHỨC HỆ NANO CHITOSAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ