BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐẮC TÙNG BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐẮC TÙNG BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền – những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn tôi, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Văn Giang, ThS. Phạm Thị Hiền cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thiện được đề tài nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập ở trường. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Nguyễn Đắc Tùng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1 Cây Sen và một số chế phẩm từ lá cây 3 1.1.1 Cây sen 3 1.1.2 Chiết xuất , tinh chế và phân lập alkaloid trong lá sen 4 1.1.2.1 Chiết xuất 4 1.1.2.2 Tinh chế và phân lập. 5 1.1.3 Một số chế phẩm từ lá cây 6 1.2 Hợp chất Nuciferin 6 1.2.1 Công thức, tính chất 6 1.2.2 Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dƣợc liệu 7 1.2.3 Tác dụng dƣợc lý. 7 1.2.3.1 Aporphin alkaloid (aporphinoid) 7 1.2.3.2 Tác dụng dƣợc lý của dịch chiết sen và của nuciferin 8 1.2.3.3 Một số tác dụng dƣợc lý đã đƣợc nghiên cứu ở sản phẩm demethyl hóa 10 1.3 Tổng quan về các phƣơng pháp demethyl hóa 11 1.3.1 Phƣơng pháp O-demethyl hóa các aryl-methyl ether 11 1.3.2 Các phƣơng pháp demethyl hóa nuciferin 14 1.4 Các phƣơng pháp O-alkyl hóa bằng tác nhân 2-cloroethanol 16 1.4.1 Phƣơng pháp sử dụng K 2 CO 3 trong dung môi Acetonitril 16 1.4.2 Phƣơng pháp sử dụng K 2 CO 3 trong dung môi DMF 17 1.4.3 Phƣơng pháp sử dụng NaOH trong nƣớc 17 CHƢƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên vật liệu 19 2.2 Thiết bị và dụng cụ 20 2.3 Nội dung nghiên cứu 21 2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen 21 2.3.2 Thực hiện demethyl hóa nuciferin 21 2.3.3 Thực hiện O-alkyl hóa sản phẩm O-demethylnuciferin bằng tác nhân EC 21 2.3.4 Thử tác dụng sinh học 22 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin 22 2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm 23 2.4.3 Thử tác dụng sinh học 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. 24 3.1 Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen 24 3.1.1 Quy trình chiết nuciferin 24 3.1.2 Tinh chế Nuciferin. 24 3.2 Bán tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-hydroxy-1-methoxy-6-methyldiabenzoquinolin (N-methyl-asimilobin, II) 24 3.2.1 Demethyl hóa Nuciferin sử dụng tác nhân HBr 24 3.2.2 Tiến hành demethyl hóa nuciferin sử dụng tác nhân HBr xúc tác KI 27 3.2.3 Đề xuất quy trình bán tổng hợp sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid 27 3.3 Tổng hợp 5,5a,7,8-tetrahydro-2-(2-hydroxyethyl)-1-methoxy-6- methyldiabenzoquinolin (2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin, V) 28 3.3.1 Sử dụng môi trƣờng NaOH loãng 29 3.3.2 Sử dụng dung môi DMF, xúc tác K 2 CO 3 31 3.3.3 Sử dụng dung môi acetonitril, xúc tác K 2 CO 3 31 3.3.4 Đề xuất quy trình 32 3.4 Kết quả phân tích cấu trúc của nuciferin và các sản phẩm bán tổng hợp 34 3.5 Kết quả thử tác dụng chống oxy hóa của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid (II) và sản phẩm 2-hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V) 37 BÀN LUẬN 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………….…49 1. KẾT LUẬN 49 2. ĐỀ XUẤT 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DMF Dimethylformamid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EC 2-Cloroethanol ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) EtOH Ethanol EtSNa Natri thioethoxid 1 H-NMR n (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) IR (Infrared Spectroscopy) IUPAC Hiệp hội Hóa học Quốc tế (International Union of Pure and Applied Chemistry) MeOH Methanol SKLM Sắc ký lớp mỏng SN 2 Phản ứng thế ái nhân lƣỡng phân tử (Nucleophilic Substitution) SOD Superoxid t o nc Nhiệt độ nóng chảy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số alkaloid trong lá sen………………………………………… 4 Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm 19 Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm………… 20 Bảng 3.1. Khảo sát lƣợng HBr 48% (ml) ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng bán tổng hợp (II)………………………………………………………… 26 Bảng 3.2. Khảo sát lƣợng KI ảnh hƣởng đến thời gian phản ứng monodemethyl hóa nuciferin………………………………………………………… 27 Bảng 3.3. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin (IR, KBr)…………… 34 Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của nuciferin……………………………………………………………… 34 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của N-methyl-asimilobin hydrobromid (IR, KBr)…………………………………… 35 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm N-methyl-asimilobin hydrobromid ( 1 H-NMR, DMSO)……………… 36 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton của sản phẩm 2- hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin ( 1 H-NMR, MeOD)……………… 37 Bảng 3.8. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do DPPH……………. 38 Bảng 3.9. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng dọn gốc tự do SOD……… 39 Bảng 3.10. Tác dụng dọn gốc tự do DPPH ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC 50 của mẫu thử…………………………………………………… 40 Bảng 3.11. Tác dụng dọn gốc tự do SOD ở nồng độ 300, 100, và 10 µg/ml và IC 50 của mẫu thử……………………………………………………………. 40 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)……………………………………. 3 Hình 2. Công thức chung các alkaloid phổ biến trong lá sen ……………… … 4 Hình 3. Công thức cấu tạo của nuciferin ……………………………………… 6 Hình 4. Công thức cấu tạo nhân aporphin……………………………………… 7 Hình 5. Công thức cấu tạo N-methyl-asimilobin……………………………… 11 Hình 6. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiI và quinolin………. 12 Hình 7. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng LiCl và DMF………… 12 Hình 8. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlCl 3 trong CH 3 CN… 12 Hình 9. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng AlBr 3 trong CH 3 CN… 13 Hình 10. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa bằng cách sử dụng H 2 SO 4 …………… 13 Hình 11. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và NaI……………… 14 Hình 12. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% và AcOH…………… 14 Hình 13. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng EtSNa trong DMF… 15 Hình 14. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HI 57% và Ac 2 O …………… 15 Hình 15. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa sử dụng HBr 48% 16 Hình 16. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K 2 CO 3 trong dung môi CH 3 CN …… 16 Hình 17. Phản ứng O-alkyl hóa sử dụng K 2 CO 3 trong dung môi DMF ………… 17 Hình 18. Phản ứng O-alkyl hóa trong môi trƣờng NaOH loãng…………………. 17 Hình 19. Sơ đồ phản ứng demethyl hóa nuciferin sử dụng HBr 48% 25 Hình 20. Cấu trúc sản phẩm phụ (III) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin. 26 Hình 21. Cấu trúc sản phẩm phụ (IV) của phản ứng monodemethyl hóa nuciferin 26 Hình 22. Sơ đồ dụng cụ đề xuất cho phản ứng demethyl hóa nuciferin……… 28 Hình 23. Sơ đồ phản ứng tạo sản phẩm O-alkyl hóa nuciferin………………… 29 Hình 24. Cấu trúc sản phẩm phụ (VI) của phản ứng O-alkyl hóa……………… 30 Hình 25. Cấu trúc sản phẩm phụ (VII) của phản ứng O-alkyl hóa………………. 31 Hình 26. Quy trình đề xuất cho phản ứng O-alkyl hóa chất (II) để tổng hợp sản phẩm thế của nuciferin: 2-Hydroxyethyl-1-methoxy-aporphin (V)……………… 33 Hình 27. Vai trò xúc tác của KI trong phản ứng demethyl hóa………………… 42 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ở nhiều quốc gia trên thế giới, nhất là ở các nƣớc đang phát triển, xu thế con ngƣời bắt đầu sử dụng nhiều các loại thuốc chữa bệnh và bồi dƣỡng sức khỏe có nguồn gốc từ thảo dƣợc hơn là sử dụng thuốc tân dƣợc vì nó ít độc hại hơn và ít tác dụng phụ hơn. Hơn nữa, hiện còn nhiều triệu chứng và bệnh hiểm nghèo chƣa có thuốc đặc hiệu để chữa trị, ngƣời ta hi vọng rằng từ nguồn động thực vật tự nhiên hoặc từ vốn trí tuệ bản địa của các cộng đồng, qua nghiên cứu sàng lọc có thể cung cấp cho nhân loại những hợp chất có hoạt tính sinh học cao để làm ra các loại thuốc mới có hiệu quả chữa bệnh nhƣ mong muốn [1]. Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn dƣợc liệu phong phú đa dạng làm thuốc với những bài thuốc y học cổ truyền đã có hiệu quả trong việc phòng và chữa trị nhiều bệnh. Những tác dụng cũng nhƣ chất lƣợng của những bài thuốc đang dần dần đƣợc chứng minh và kiểm soát. Trong rất nhiều loại dƣợc liệu đƣợc sử dụng để chữa bệnh, có Sen là một loài rất phổ biến ở Việt Nam. Sen tên khoa học là Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen – Nelumbonaceae. Từ xƣa đến nay sen đã đƣợc sử dụng trong rất nhiều bài thuốc y học cổ truyền ở các nƣớc phƣơng Đông nhƣ Việt Nam, Trung Quốc, Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của sen. Trong cây sen, các alkaloid chiếm tới 0,7-0,8%, với nuciferin là alkaloid chính. Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra đƣợc rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các bộ phận cây sen cũng nhƣ của nuciferin, điển hình nhƣ tác dụng chống ung thƣ [36], chống HIV [41], chống tăng lipid máu [36], hay có tác dụng chống oxy hóa mạnh [37]. Nhờ có ƣu thế về nguồn nguyên liệu cây sen cũng nhƣ là tiềm năng của nó trong y dƣợc học, cây sen trong những năm gần đây đƣợc đƣa vào nghiên cứu rất nhiều ở Việt nam. Với nguồn nguyên liệu nuciferin sẵn có và dễ tách [...]... suất cao, việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là một hƣớng phát triển để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh Đề tài Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1 Bán tổng hợp một số dẫn chất nuciferin 2 Thử tác dụng chống oxy hóa của các dẫn chất bán tổng hợp đƣợc 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Cây Sen và một số chế phẩm từ... enzym - Tác dụng chống oxy hóa và loại bỏ các gốc tự do 8 - Ảnh hƣởng đến quá trình kết tập tiểu cầu - Hạ huyết áp và chống loạn nhịp tim - Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus - Gây độc tế bào và tác dụng chống khối u - Tác dụng miễn dịch - Tác dụng chống viêm và tác dụng vảo vệ tế bào - Tác động gây đột biến, gây độc cho gen và phá hủy cấu trúc nhiễm sắc thể [22,39] 1.2.3.2 Tác dụng dược lý của dịch... đƣợc tác dụng chống HIV tốt thông qua các đánh giá các giá trị EC50 và TI (chỉ số điêu trị) Nuciferin là alkaloid chính trong lá và phôi của Nelumbo nucifera, đây là một alkaloid aporphin, tác dụng chống HIV ở EC50 là 0,8 µg/ml và TI là 36 [41] - Tác dụng chống oxy hóa: Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết cồn của hạt Nelumbo nucifera để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vitro và in... dịch chiết sen và của nuciferin Với y học cổ truyền, ngƣời ta sử dụng các bộ phận của cây sen trong những bài thuốc khác nhau dung để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, ngày nay khoa học đã chứng minh đƣợc nhiều tác dụng của những bài thuốc cổ truyền có nguồn gốc từ các alkaloid có trong sen (nuciferin là alkaloid chính) cũng nhƣ tìm ra nhiều tác dụng mới của sen - Tác dụng chống HIV: Với một số alkaloid... học và Công nghệ Việt Nam, trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR): Đƣợc ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là DMSO và MEOD với chất chuẩn nội là tetramethylsilan 2.4.3 Thử tác dụng sinh học Thử tác dụng chống oxy hóa: Phƣơng pháp đánh giá tác dụng. .. thể kết luận sen và các hoạt chất có trong sen, đặc biệt là các alkaloid với nuciferin là thành phần chính có thể có rất nhiều tác dụng sinh học, tác dụng tốt với nhiều bệnh mà hiện con ngƣời vẫn còn đang trong quá trình nghiên cứu và chƣa tìm ra phƣơng pháp chữa hiệu quả, sen và các alkaloid trong sen có một giá trị tiềm năng lớn về mặt khoa học trong tƣơng lai 1.2.3.3 Một số tác dụng dược lý đã được... alkaloid có tác dụng chống sốt rét hoặc chống nấm Tuy nuciferin không có tác dụng này, nhƣng ngƣời ta phát hiện ra một mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có liên quan mật thiết với nhóm thế ở vị trí C1 và C2 trên vòng aporphin (hình 5) Đây đƣợc coi là một hƣớng nghiên cứu mới với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này ở nuciferin [40] - Kích thích tiết insulin: Nuciferin chiết từ lá sen có tác dụng kích thích... Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin - Sử dụng phƣơng pháp chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ ở môi trƣờng kiềm - Sử dụng các phƣơng pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến: phƣơng pháp demethyl hóa, O-alkyl hóa… - Sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silica gel GF254 Merck 70-230 mesh và hệ... khiết - Sử dụng phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt để sơ bộ định tính và xác định độ tinh khiết - Sử dụng các phƣơng pháp kết tinh, sắc ký điều chế để tách và tinh chế sản phẩm 23 Tổng hợp hóa học thực hiện tại Phòng Tổng hợp Hóa dƣợc, Bộ môn Công nghiệp Dƣợc, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội 2.4.2 Xác định cấu trúc sản phẩm Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp đƣợc đƣợc... trong thử tác 9 dụng chống oxy hóa với các phƣơng pháp tƣơng tự Ngoài ra, ngƣời ta đánh giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột bạch tạng Thụy Sĩ , không thấy có dấu hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lƣợng cơ thể [37] - Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid đƣợc chiết đƣợc từ lá sen đã đƣợc thử nghiệm Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã đƣợc thử nghiệm thì một vài . Bán tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất của nuciferin đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Bán tổng hợp một số dẫn chất nuciferin. 2. Thử tác dụng chống oxy hóa của các dẫn. TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐẮC TÙNG BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐẮC TÙNG BÁN TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA NUCIFERIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC