Thông tin tài liệu
B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI LÊ THỊ NGC HIỆP GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MENTNG HP KHNG SINH TỪSTREPTOMYCES 119.112 KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S H NI-2013 B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI LÊ THỊ NGC HIỆP GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH TỪ STREPTOMYCES 119.112 KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S Ngưi hưng dn: Ths. Võ Thị Thu Thủy Nơi thc hin: B môn Vi sinh& Sinh hc Trưng Đại hc Dưc H Ni H NI-2013 LI CẢM ƠN Tôi xin gi li cm ơn sâu sc nhất đn cô gio Ths. Võ Thị Thu Thủy ngưi đ tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hon thin kha lun ny. Tôi xin chân thnh cm ơn cc thy cô giáo, cc cn b, k thut viên ging dy, công tc ti B môn Vi sinh - Sinh hc , B môn Công nghip dưc trưng Đi hc Dưc H Ni , B môn Ha vt liu - khoa Ha trưng Đi hc Khoa hc tự nhiên H Ni đ gip đ tôi trong thi gian lm thực nghim. Nhân dịp ny tôi cng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng ton th cc thy cô gio trưng Đi hc Dưc H Ni đ dy d v to mi điu kin thun li cho tôi trong thi gian tôi hc tp ti trưng. V cui cng l li cm ơn tôi gi ti gia đnh v bn b đ đng viên , gip đ tôi trong sut thi gian thực hin kha lun. Do thi gian lm thực nghim cng như kin thc của bn thân c hn , khóa lun ny cn c nhiu thiu st . Tôi rất mong nhn đưc sự gp của cc thy cô , bn b đ kha lun đưc hon thin hơn. Tôi xin chân thnh cm ơn! H Ni, ngày 10, tháng 5, năm 2013. Sinh viên LÊ THỊ NGỌC HIỆP MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TNG QUAN 2 1.1. Đi cương v khng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa khng sinh 2 1.1.2. Phân loi khng sinh 2 1.1.3. Cơ ch tc dụng của khng sinh 3 1.2.Đi cương v x khuẩn 3 1.2.1. Đặc đim hnh thi của x khuẩn 4 1.2.2. Đặc đim của x khuẩn chi Streptomyces 5 1.3. Sơ đồ tổng qut sinh tổng hp khng sinh……………………………………….…6 1.4.Tuyn chn, ci to v bo qun ging x khuẩn 6 1.4.1. Mục đích 7 1.4.2. Chn chủng c HTKS cao bằng sng lc ngu nhiên 7 1.4.3. Đt bin ci to ging…. 7 1.4.4. Bo qun ging x khuẩn …………………………………………………… 8 1.5. Lên men sinh tổng hp khng sinh 8 1.5.1. Cc phương php lên men 9 1.5.2. Mt s yu t nh hưởng đn qu trnh lên men 10 1.6. Chit tch v tinh ch khng sinh t dịch lên men 10 1.6.1. Vai tr của chit tch v tinh ch khng sinh 10 1.6.2. Cc phương php chit tch 11 1.7.Bưc đu nghiên cu cấu trc khng sinh 12 1.7.1. Phổ t ngoi - kh kin 12 1.7.2. Phổ hồng ngoi 12 1.7.3. Khi phổ 13 1.8. Mt s nghiên cu liên quan…………………………………………………… 13 1.8.1. So sánh glucose và glycerol làm nguồn carbon cho sn xuất ε-poly- L-Lysin tStreptomyces sp. M-Z18………………………………………………………… 13 1.8.2. Tinh ch i lực Phosphoprotein xc định các protein tham gia vào S- adenosyl-L-methionine lm tăng cưng sn xuất khng sinh trong Streptomycescoelicolor……………………………………………………………… 14 1.8.3. Xc định định hot tính sinh hc của mt nhm gồm 51 macrolide bằng cch kích hot enzyme tổng hp polyketide trong Streptomyces ambofaciens……… 14 CHƯƠNG 2: ĐI TƯNG V PHƯƠNG PHP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vt liu v thit bị 16 2.1.1. Nguyên vt liu 16 2.1.2. My mc thit bị 18 2.2. Ni dung nghiên cu 18 2.2.1. Chn lc, ci to ging 18 2.2.2. Lên men, chit tch khng sinh ti ưu 18 2.2.3. Sơ b xc định mt s tính chất của khng sinh thu đưc 19 2.3. Phương php thực nghim 19 2.3.1. Nuôi cấy v gi ging x khuẩn 19 2.3.2. Đnh gi hot tính khng sinh bằng phương php khuch tn 19 2.3.3. Chn lc ngu nhiên 20 2.3.4. Đt bin ……………………… 21 2.3.5. Lên men chm tổng hp khng sinh 22 2.3.6. Chit khng sinh t dịch lên men bằng dung môi hu cơ 23 2.3.7. Tch cc thnh phn trong khng sinh bằng sc k lp mỏng 23 2.3.8. Thu kháng sinh thô bằng phương php cất quay 24 2.3.9. Tinh ch khng sinh thô bằng sc k ct 24 2.3.10. Phương php xc định khng sinh tinh khit thu đưc 25 CHƯƠNG 3: KT QUẢ THỰC NGHIỆM V NHN XÉT 26 3.1. Kt qu sng lc ngu nhiên 26 3.2. Kt qu đt bin ci to ging ln 1 27 3.3. Kt qu đt bin ci to ging ln 2 27 3.4. Kt qu đt bin ha hc bằng HNO 2 28 3.5. Kt qu chn môi trưng lên men chm 29 3.6. Kt qu chn chủng lên men 30 3.7. Kt qu chn dung môi v pH chit 30 3.8. Kt qu sc k lp mỏng chn h dung môi 31 3.9. Kt qu sc kí ct………………… 32 3.9.1. Kt qu sc k ct ln 1 32 3.9.2. Kt qu sc k ct ln 2 34 3.9.3. Kt qu sc k ct ln 3 36 3.10. Kt qu đo nhit đ nng chy, đo phổ của khng sinh tinh khit 39 KT LUN V KIN NGHỊ 41 DANH MỤC CC KÝ HIỆU, CC CHỮ VIT TẮT ISP International Streptomyces Project (Chương trnh Streptomyces quc t) ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic ATCC 6633 Trung tâm gi ging Hoa Kỳ BV 108 Bnh vin 108 B.subtilis Bacillussubtilis ATCC 6633 ĐB1 Đt bin ln 1 ĐB2 Đt bin ln 2 ĐBHH Đt bin ha hc G(+) Gram dương G(-) Gram âm HTKS Hot tính khng sinh MC Mu chng MT Môi trưng MT1dt Môi trưng dịch th 1 MT2dt Môi trưng dịch th 2 MT6dt Môi trưng dịch th 6 P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108 SLNN Sng lc ngu nhiên VSV Vi sinh vt DANH MỤC CC BẢNG Bng 1: Cc vi khuẩn kim định Bng 2: Cc MT nuôi cấy x khuẩn Bng 3: Cc MT nuôi cấy VSV kim định Bng 4: Cc dung môi đ s dụng Bng 5: Kt qu th HTKS sng hc ngu nhiên Bng 6: Kt qu th HTKS đt bin ln 1 Bng 7: Kt qu th HTKS đt bin ln 2 Bng 8: Kt qu th HTKS đt bin ha hc Bng 9: Kt qu chn môi trưng lên men chm Bng 10: Kt qu chn chủng lên men Bng 11: Kt qu chn dung môi v pH chit Bng 12: Kt qu SKLM chn h dung môi Bng 13: Kt qu th HTKS cc phân đon sau chy sc k ln 1 Bng 14: Kt qu SKLM sau chy ct ln 1 Bng 15: Kt qu th HTKS cc phân đon sau chy sc k ln 2 Bng 16: Kt qu SKLM cc phân đon sau chy ct ln 2 Bng 17: Kt qu th HTKS nhm 2 sau chy ct Bng 18: Kt qu SKLM nhm 2 sau chy ct Bng 19: Kt qu th HTKS nhm 3 sau chy ct Bng 20: Kt qu SKLM nhm 3 sau chy ct Bng 21: Kt qu IR DANH MỤC CC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hnh 1: Sơ đồ cơ ch tc dụng của cc h khng sinh chính Hnh 2: Sơ b phân loi x khuẩn Hnh 3: Cc khuẩn ty ở x khuẩn Hnh 4: Sơ đồ tổng qut lên men sn xuất khng sinh Hnh 5: Đưng cong sinh trưởng pht trin x khuẩn Hnh 6: Pic sc k ct ln 1 Hnh 7: Pic sc k ct ln 2 Hnh 8: Pic sc k ct ln 3 nhm 2 Hnh 9: Pic sc k ct ln 3 nhm 3 Hnh PL1: X khuẩn giai đon pht trin 5-6 ngày Hnh PL2: Kt qu đt bin bằng nh sng UV Hnh PL3: Th HTKS bằng phương php khi thch(P. mirabilis) Hnh PL4: Th HTKS bằng phương php ging thch (B. subtilis) Hnh PL5: Th HTKS bằng phương php khoanh giấy lc(B. subtilis) Hình PL6: Kt qu chn MT lên men chìm Hnh PL7: Kt qu chn chủng lên men Hnh PL8: Kt qu SKLM sau chy ct ln 1 Hnh PL9: Kt qu chy sc k ct Hnh PL10: Kt qu đo phổ UV của khng sinh Hnh PL11: Kt qu đo phổ IR của khng sinh Hnh PL12: Kt qu đo phổ khi của khng sinh 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vic khm ph v pht trin cc khng sinh đ to ra cc th lực v khí hu hiu gip con ngưi chng li vi khuẩn. Phm vi điu trị của khng sinh hin nay không chỉ dng li ở cc bnh nhiễm khuẩn, m khng sinh cn đưc dng ngy mt nhiu đ điu trị ung thư. Tuy nhiên, vic nghiên cu pht trin khng sinh mi đang c xu hưng gim theo thi gian. Trong khi đ, mô hnh cc bnh nhiễm khuẩn ngy cng đa dng, vic s dụng khng sinh ngy mt trn lan, tnh hnh khng khng sinh ngy cng gia tăng v đang l mi lo ngi ton cu. Hin trng đ đang l ting chuông cnh bo, con ngưi sẽ thua trong cuc chin chng vi khuẩn. V vy, đẩy mnh nghiên cu, sn xuất cc khng sinh c hiu qu điu trị cao, đc tính thấp v ít bị khng thuc l mt yêu cu tất yu v cấp thit trong công cuc bo v v chăm sc sc khỏe ngưi dân. Trong tất c cc khng sinh đưc bit đn hin nay th c khong 55% c nguồn gc t x khuẩn v 60% trong s đ thuc chi Streptomyces. Đ l cơ sở đ cc nh khoa hc nưc ta hin nay tp trung nghiên cu vo chi x khuẩn ny. Chính v vy, em chn đ ti: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng hp kháng sinh từ Streptomyces 119.112” lm kha lun tt nghip. Chủng Streptomyces 119.112 do B môn Vi sinh – Sinh hc trưng đi hc Dưc H Ni phân lp v cung cấp. Kha lun mong mun đt đưc cc mục tiêu sau đây: - Nâng cao hiu suất sinh tổng hp khng sinh t chủng Streptomyces 119.112bằng sng lc ngu nhiên v đt bin ci to ging. - Lựa chn môi trưng v bin chủng thích hp cho qu trnh lên men. - Chit tch v tinh ch khng sinh thu đưc. - Tng bưc xc định đnh gi tính chất vt l v cấu trc ha hc của khng sinh do chủng Streptomyces 119.112. [...]... pháp giếng thạch • Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 của các biến chủng trên MT1dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, thử hoạt tính dịch lọc bằng phương pháp giếng thạch , sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất 2.3.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ Mục đích: Xác định... ưu Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất Tìm dung môi hữu cơ chiết dịch lọc của dịch lên men và pH chiết tốt nhất Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết... trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2°C và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [9], [13] 1.5 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng Kháng sinh là một trong những sản phẩm của quá trình lên men xạ khuẩn... tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid 1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 7 Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối Dịch chiết đậm đặc Sản phẩm tinh chế Sản phẩm... Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng (tetracyclin) Các kháng sinh polypeptid (polymyxin, bacitracin) Các kháng sinh macrolid (erythromycin, spiramycin) Các kháng sinh polyen (nystatin, amphotericin B) Các kháng sinh nhóm antracyclin chống ung thư (daunorubicin) 3 Các kháng sinh nhóm actinomycin chống ung thư (dactinomycin D) 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật... dung nghiên cứu Để đạt được các mục tiêu ban đầu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu cụ thể như sau: 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn 3 dạng chủng có HTKS cao nhất 20 Đột biến bằng ánh sáng UV từ 1 đến 2 lần để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc Đột biến hóa học 2.2.2 Lên men, chiết tách kháng sinh tối ưu Từ. .. lên men liên tục 11 - Lên men mẻ (lên men có chu kỳ): VSV được nuôi cố định trong bình lên men với 1 thể tích MT xác định VSV phát triển theo giai đoạn và tạo ra sản phẩm Kết thúc quá trình, người ta thu lấy sản phẩm - Lên men có bổ sung: trong quá trình nuôi cấy có bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để làm cho mật độ tế bào trong bình tăng lên Do đó, nâng sao hiệu quả sử dụng bình lên men - Lên men. .. cho sinh tổng hợp chất mong muốn [13] 1.6 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 1.6.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 12 Đây là giai đoạn có vai trò rất quan trọng bởi vì sản phẩm thu được sau quá trình lên men thường không bền vững, hàm lượng kháng sinh trong dịch lên men thường thấp Do đó, cần tách riêng kháng sinh khỏi các tạp chất khác và tinh chế sản phẩm đạt được các tiêu... CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, nguyên sinh động vật, …) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [9], [15] Cần phân biệt một số chất cũng do vi sinh. .. gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó.[16] Hình 1 giới thiệu sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính Hình 1: Sơ đồ cơ chế tác dụng của các họ kháng sinh chính Ức chế quá trình tổng hợp vách TB vi khuẩn: -lactam, nhóm Glycopeptid Tác động lên tổng hợp protein của vi khuẩn: tetracycline, aminoglycosid (lên tiểu đơn vị 30S), . vy, em chn đ ti: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hp kháng sinh từ Streptomyces 119. 112 lm kha lun tt nghip. Chủng Streptomyces 119. 112 do B môn Vi sinh – Sinh hc trưng đi hc. GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN TNG HP KHNG SINH TỪ STREPTOMYCES 119. 112 KHÓA LUN TT NGHIỆP DƯC S Ngưi hưng dn: Ths. Võ Thị Thu Thủy Nơi thc hin: B môn Vi sinh& amp; Sinh. trnh lên men cao. • Nhưc đim: Đu tư trang thit bị k thut ban đu ln. • Cc phương php lên men chm: Lên men mẻ, lên men c bổ sung, lên men bn liên tục, lên men liên tục. 11 - Lên
Ngày đăng: 28/07/2015, 16:58
Xem thêm: Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 119.112, Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 119.112, Kháng chuyển hóa: acid folic, sulfamid, trimethoprim., CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, Đột biến bằng ánh sáng UV, CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT, Nguyễn Lân Dũng (2001), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr. 39-67., Hình PL1: Xạ khuẩn giai đoạn phát triển 5-6 ngày, Hình PL5: Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc (B. subtilis)