BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LƯOfNG THỊ THANH HUYÈN TỔNG HỢP N^-(3-(HYDROXYAMINO)-3- OXOPROPYL)-N^-PHENYLSUCCINAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT HƯỚNG ức CHÉ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ • • • Người hướng dẫn: 1. ThS. Đào Thị Kim Oanh 2. DS. Trần Thị Oanh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược I ^ thư HÀ NỘI - LỜI CẢM ƠN Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến PGS. TS Nguyễn Hải Nam, ThS. Đào Thị Kim Oanh, DS. Trần Thị Oanh - Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những ngưòi đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa dược - Trưòng Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học KHTN Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này và xin cảm ơn sự chỉ bảo dạy dỗ của tất cả các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội trong thời gian học tập tại trưÒTig. Tuy nhiên chỉ thực hiện khóa luận tốt nghiệp trong một thời gian ngắn, nên với tầm hiểu biết hiện có của mình, chắc chắn bài khóa luận khó tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong muốn nhận được sự đóng góp, phê bình của các thầy cô và các bạn để bài khóa luận tốt nghiệp được hoàn chỉnh hơn. Cuối cùng Tôi xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn luôn ở bên khích lệ, động viên, giúp đỡ em trong học tập cũng như trong cuộc sống. Hà Nội, ngày 08/05/2011 Sình viên Lương Thị Thanh Huyền DANH MỤC KÝ HIỆU, DANH MỤC CÁC CHỮ VIÉT TẮT Ký hiệu Chú giải - NMR Phổ cộng hưỏrng từ - NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân GDI 1,1 ’-carbonyl diimidazol CHAP Dan chất acid hydroxamic có chứa peptid vòng CTCL ư lympho tế bào T dưới da CTCT Công thức cấu tạo DCM Dicloromethan DMF N,N-dimethylformamid HAT Histon transferase HDAC Enzym histon deacetylase HDACi Các chất ức chế HDAC IC50 Nông độ ức ché 50% IR Phổ hồng ngoại MeOH Methanol MS Phổ khối lượng NST Nhiễm sắc thể TLC Sắc ký lófp mỏng DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1 Khả năng ức chế HDAC và kháng tế bào ung thư của 1 số chất ức chế HDAC 16 2 Tổng hợp tính chất lý hóa, Rf và hiệu suất của dãy chẩt H1-H4 30 3 Tổng hợp tính chất lý hóa, R f và hiệu suất của dãy chất HelHe4 34 4 Tổng hợp tính chất lý hóa, hiệu suất tổng hợp dãy chất Hal-Ha4 39 5 Tông hợp nhiệt độ nóng chảy và Rf của các chât từ Hal-Ha4 40 6 Phân tích phô hông ngoại dãy chât H1-H4 40 7 Phân tích phô khôi dãy chât Hel-He4 41 8 Phân tích phô hông ngoại dãy chât Hal-Ha4 43 9 Phân tích phô khôi dãy chât Hal-Ha4 44 10 Ket quả phân tích phổ ’H-NMR của dãy chất Hal-Ha4 45 11 Ket quả phân tích phổ *^C-NMR của dãy chất Hal-Ha4 46 12 Bảng giá trị IC50 của dãy chât Hal-Ha4 49 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình Tên hình Trang 1 Câu trúc AND, nucleosom và nhiêm săc thê 3 2 Vai trò cân băng động giữa HD AC và HAT 4 3 Biêu đô mô tả các loại HD AC 6 4 Câu trúc của HDAC7, 8 8 5 Vị trí hoạt động của HDLP khi có mặt acetyl ly sin histon vàTSA 9 6 Cơ chê phản ứng deacetyl hóa của HD AC 9 7 Công thức một sô chât ức chê HD AC 11 8 Tác dụng chính của các chât ức chê HD AC 15 9 Công thức cô điên của HD A Ci và vị trí của HD A Ci trong túi enzytn HD AC 17 10 Phản ứng điêu chê SAHA từ methyl suberanilat 20 11 Cơ chê hoạt hóa anhydride băng pyridin 21 12 Cơ chê hoạt hóa acid carboxylic với CDI 21 13 Kêt quả phân tích Westen Blot 49 14 So sánh câu trúc 3D của Ha2 và SAHA 50 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦNI: TỐNG QUAN 3 1.HISTO N 3 2. HISTON DEACETYLASE 4 2.1. Định nghĩa 4 2.2. Phân loại 5 2.3. Sự phân bố của HD AC 7 2.4. Cấu trúc của HDAC và cơ chế phản ứng deacetyl hóa 7 2.5. Sự hình thành khối u và vai trò của HD AC 10 3. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE 11 3.1. Phân loại 11 3.1.1. Acid hydroxamic 12 3.1.2. Benzamid 12 3.1.3. Acid béo mạch ngắn 13 3.1.4. Peptid vòng 13 3.1.5. Các chất khác 14 3.2. Cơ chế tác dụng 14 3.2.1. Trên tế bào thường 14 3.2.2. Trên tế bào ung thư 14 3.3. Liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HD A C 17 3.3.1. Công thức cấu tạo chung của các chất ức chế HD AC 17 3.3.2. Liên quan giữa cấu trúc - tác dụng 17 3.3.2.1. Thay đổi nhóm nhận diện bề m ặt 17 3>3.2.2. Thay đổi phần cầu nối 19 3.3.2.3. Thay đổi nhóm chức tạo chelat với kẽm 19 4. TỔNG HỢP HÓA HỌC 20 4.1. Tổng họp acid hydroxamic 20 4.2. Acyl hóa amin bằng anhydrid acid 20 4.3. Acyl hóa amin bằng acid carboxyclic 21 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚXJ . 22 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT B Ị 22 2.1.1. Hóa chất 22 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 22 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN cứ u 23 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 23 2.3.1. Tổng họp hóa học 23 2.3.2. Xác định cấu trúc 23 2.3.3. Thử tác dụng ức chế HDAC và kháng tế bào ung th ư 24 2.3.3.1. Phân lập histon và Western Blot 24 23.3.2. Thử độc tính tế bào in vitro: 25 2.3.4. Đánh giá mối liên quan cấu trúc - tác dụng 26 PHẦN 3: THựC NGIỆM - KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 27 3.1. HÓA HỌC 27 3.1.1. TỔNG HỢP HÓA HỌC 27 3.1.1.1. Tổng họp acid 4-oxo-4-(phenylamino)butanoic và dẫn chất (dãy Hl- H4) 27 3.1.1.2. Tổng hợp methyl 3-(4-oxo-4-(phenylamino)butanamido)propanoat và dẫn chất (dãy He 1 -He4) 31 3.1.1.3. Tổng hợp N'-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N‘^-phenylsuccinamid và dẫn chất (dãy Hal-Ha4) 35 3.1.2. KIỂM TRA Đ ộ TINH KHIẾT CỦA SẢN PHẨM 39 3.1.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 40 3.1.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại dãy H 1-H4 40 3.1.3.2. Phổ khối của dãy chất Hel-He4 41 3.1.3.3. Phổ hồng ngoại của dãy chất Hal-Ha4 42 3.1.3.4. Phổ khối của dãy chất Hal-Ha4 44 3.1.3.5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Hl-NMR của dãy Hal-Ha4 44 3.1.3.6. Phổ cộng hưởng từ C13-NMR của dãy H al-Ha4 46 3.2. THỬ TÁC DỤNG ức CHẾ HDAC VÀ KHÁNG TẾ BÀO ƯNG THƯ 47 3.3. BÀN LUẬN 47 3.3.1. Tổng hợp hóa học 47 3.3.2. Tác dụng ức chế histon deacetylase và độc tính tế bào 48 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUÁT 51 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội đang ngày càng phát triển, và một trong những mục tiêu phát triển xã hội là không ngừng cải thiện và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người. Tuy nhiên, cùng với sự phát triển tiến bộ của xã hội loài người là sự gia tăng ô nhiễm môi trường, cạn kiệt tài nguyên và đặc biệt là sự xuất hiện và phát triển của nhiều loại bệnh khác nhau. Mô hình bệnh tật của con người càng ngày càng trở nên phức tạp, do đó việc nghiên cửu và phát triển thuốc mới là rất cần thiết. Một trong các bệnh lý đang gia tăng nhanh chóng trong những năm gần đây là ung thư. Hiện nay các thuốc điều trị ung thư đều là các thuốc gây độc tế bào, tác dụng lên cả tế bào ung thư và tế bào thường nên có nhiều tác dụng không mong muốn. Vì vậy xu hướng chính trong nghiên cứu và phát triển thuốc mới hiện nay là nghiên cứu các thuốc điều trị ung thư với con đường nghiên cứu ngắn nhất là sàng lọc thuốc theo các mục tiêu phân tử như: Histon deacetylase, các protein kinase, telomerase, phosphoinositide-3-kinase (PI3K) Vai trò của các enzyme histon deacetylase (HDAC) và histon transferase (HAT) trong sự hình thành và phát triển của tế bào ung thư ngày càng được khẳng định. Sự mất cân bằng giữa HDAC và HAT là một trong những nguyên nhân chính hình thành khối u. Do vậy việc nghiên cứu các thuốc ức ché HDAC (HDACi) là một hướng đi quan trọng để phát triển các thuốc kháng ung thư mới. Acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA- biệt dược Varinostat, Zolinza®) là chất ức chế HDAC đầu tiên được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da (2006) và tiếp theo đó là Romidepsin (2009). Điều này chứng tỏ tiềm năng mạnh mẽ của các thuốc ức chế HDAC trong điều trị ung thư. Các chất ức chế HDAC có ưu điểm là công thức không phức tạp, dễ tổng hợp đồng thời tác dụng chọn lọc trên tế bào ung thư. Cho đến nay các dẫn chất acid hydroxamic vẫn là nhóm chất được nghiên cứu nhiều nhất trong các chất ức chế HDAC do khả năng ức chế mạnh HDAC với IC50 ở mức nanomol. Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tồng hợp N^-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N*-pĩtenylsuccinamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase^’ với 2 mục tiêu chính: - Tổng họp N’-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N'*-phenylsuccinamid và một sổ dẫn chất. - Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và độc tính tế bào in vitro của các chất tổng hợp được. [...]... đổi các nhóm thế và kết quả thử hoạt tính của các hợp chất tổng hợp được 2 .3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u - Tổng họp N^ - (3- (hydroxyamino)- 3- oxopropyl) -N"‘ -phenylsuccinamid và 3 dẫn chất - Kiểm tra độ tinh khiết - Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được - Thử tác dụng ức chế HDAC và kháng ung thư in vitro của 4 chất tổng hợp được - Đánh giá liên quan cấu trúc-tác dụng giữa các dẫn chất không có nhóm... học Việt Nam và Khoa hóa - Trường đại học KHTNHN  23 - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*H - NMR) và carbon ('^c - NMR) được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u - Tổng hợp N' - (3- (hydroxyamino)- 3- oxopropyl) -N'^ -phenylsuccinamid và dẫn chất Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và kháng tế... thấy một số nhóm dẫn chất khác cũng có tác dụng ức chế HDAC như ceton ái điện tử, dẫn chất sulafamid, thiol Hầu hết các hợp chất náy ức chế HDAC không chọn lọc hoặc ức chế chọn lọc HDAC nhóm I chỉ có vài trường hợp ức chế HDAC nhóm II như tubacin - 1 acid hydroxamic ức chế chọn lọc HDAC6 Tác dụng ức chế chọn lọc HDAC6 còn thấy ở các sulfamid Bên cạnh đó, các hợp chất nhóm ceton ái điện tử ức chế chọn... là L-Aoe, L-Aoda), và đa phần có chứa 1 prolin hoặc acid pipecolinic, trừ các CHAP là sản phẩm kết hợp peptid vòng và acid hydroxamic của L- Aoe Các chất này có thể ức chế HDAC ở mức độ nM (FK228 có IC50 từ 0,5-4,4nM) và tác dụng ức chế chọn lọc trên các HDAC 14 nhóm I: FK228 ức chế HDAC 1,2,4,6 ; CHAP 31 ức chế HDAC 1 mạnh hơn HDAC6 (IC50 tương ứng: 0 ,38 -13nM) [2 1 , 23] 3. 1.5 Các chất khác Cho đến... SAHA ức chế sự phát triển của nhiều tế bào ung thư thể rắn và u máu nên được thử nghiệm lâm sàng với nhiều loại ung thư khác nhau Từ đó các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic được nghiên cứu rộng rãi và được chia thành nhiều phân nhóm nhỏ: hydroxamic mạch thẳng, dẫn chất cinamic (LAQ 824 ( 3) , LBH 589 ( 4), PXD101( 5)) , dẫn chất phenyl Hầu hết các chất trong nhóm đều thể hiện khả năng ức chế mạnh... Ila (HDAC 4,5, 7) trong khi các ceton béo chỉ ức chế HDAC 1,2 ,3 (IC50: 50, 110, 120nM), tác dụng yếu trên HDAC6 (IC50; 34 0nM) và hầu như không ức chế HDAC 4,5,7 [ 23, 29] 3. 2 Cơ chế tác dụng Các chất ức chế HDAC xâm nhập vào vị trí xúc tác của HDAC, ngăn cản phản ứng deacetyl hóa làm tăng tỷ lệ histon và protein non -histon được acetyl hóa làm thay đổi cấu trúc, chức năng của NST cũng như chức năng của các... Đặc biệt 13 MS275 có thời gian bán thải khá dài và được thử nghiệm với liều dùng 1-2 tuần/lần Nhìn chung khả năng ức chế HDAC của benzamid không mạnh như acid hydroxamic (IC50 cỡ |iM) và hầu hết chỉ chọn lọc trên 1 số HDAC nhất định: CI 994 ức chế mạnh HDACl (IC50 = 550nM) và không ức chế HDAC2, MS275 ức chế HDACl, 3 mạnh hơn 135 lần so với HDAC 6 , 8 (với HDACl IC50 =180nM) [ 23, 29], 3. 1 .3 Acid béo... chức quan trọng trong nghiên cứu HDACi Hầu hết các dẫn chất acid 20 hydroxamic đều ức chế HDAC ở nồng độ nanomol Các hợp chất còn lại đa phần ức chế HDAC với IC50 ở mức nM Mặt khác việc thay đổi nhóm A cũng làm thay đổi tính chọn lọc của HDACi: các hợp chất benzamid (BZG là o-aminoanilin) chủ yếu ức chế chọn lọc HDAC nhóm I, còn sulfamid lại chủ yếu ức chế HDAC6 (nhóm Ilb) 4 TỔNG HỢP HÓA HỌC 4.1 Tổng. .. Khả năng ức chếHDAC và kháng tế bào ung thư của một số chất ức chếHDAC Ghi chú: GA ức chế phát triển tế bào; TD tăng biệt hóa, A: apoptosis; MF: ức chế phân bào; PP: đa bội hóa, ROS-CD; reactive oxygen species - facilitated cell death; leucemi: bệnh bạch cầu; CTCL: u lympho tế bào T dưới da; *: đã được FDA công nhận 17 3. 3 Liên quan cấu trúc- tác dụng của các chất ức chế HDAC 3. 3.1 Công thức cấu tạo... hiện khả năng chống ung thư khá hiệu quả ngay ở liều nhỏ Hầu hết các chất này đều ức chế HDAC nhóm I và II í H C 3 NHOH i CH3 7 CH3 SAHA ( 2) ÒH3 TSA ( 1) ^H O Natri butyrat ( 7) PXD 101 ( 5) acid valproic ( 6 ) Hình 7: Công thức một sổ chất ức chếHDAC 3. 1 Phân loai Các chất ức chế HDAC đang được nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng được chia thành các nhóm chính: 12 Acid hydroxamic; SAHA, TSA - Acid béo mạch . 3- (4-oxo-4-(phenylamino)butanamido)propanoat và dẫn chất (dãy He 1 -He 4) 31 3. 1.1 .3. Tổng hợp N' - (3- (hydroxyamino)- 3- oxopropyl) -N‘^ -phenylsuccinamid và dẫn chất (dãy Hal-Ha 4) 35 3. 1.2. KIỂM TRA. N^ - (3- (hydroxyamino)- 3- oxopropyl) -N*-pĩtenylsuccinamid và một số dẫn chất hướng ức chế histon deacetylase^ ’ với 2 mục tiêu chính: - Tổng họp N’ - (3- (hydroxyamino)- 3- oxopropyl) -N'* -phenylsuccinamid và một sổ dẫn chất. -. THANH HUYÈN TỔNG HỢP N^ - (3- (HYDROXYAMINO)- 3- OXOPROPYL) -N^ -PHENYLSUCCINAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT HƯỚNG ức CHÉ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ • • • Người hướng dẫn: 1. ThS.