BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ TRÀ XÁC ĐỊNH COLLAGEN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ TRÀ XÁC ĐỊNH COLLAGEN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi 2. TS. Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực hiện: 1. Bộ môn hóa phân tích và độc chất 2. Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, 48 Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội. Để có thể hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô và anh chị tại trường và viện. Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới: TS. Lê Đình Chi, bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, đại học Dược Hà Nội. Thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết để hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. TS. Lê Thị Hồng Hảo, viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giao và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này. ThS. Vũ Thị Kim Oanh, ThS. Vũ Thị Trang cùng toàn thể các anh chị trong labo Hóa độc đã luôn luôn nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện tại Viện. Các thầy cô trong trường, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá và cần thiết để có thể tham gia nghiên cứu. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã ở bên, quan tâm động viên tôi. Mặc dù đã có cố gắng, nghiên cứu của tôi còn nhiều thiếu sót và hạn chế do kiến thức và kỹ năng còn chưa được đầy đủ. Rất mong nhận được những nhận xét, góp ý từ thầy cô, anh chị và các bạn để khóa luận này được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Vũ Thị Trà MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng. 2 1.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng 2 1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng 2 1.1.3. Quản lý thực phẩm chức năng 3 1.2. Collagen. 3 1.2.1. Định nghĩa 3 1.2.2. Thành phần collagen 4 1.2.3. Cấu trúc collagen 4 1.2.4. Ứng dụng của collagen 5 1.2.5. Các phương pháp xác định collagen 7 1.2.6. Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin 9 1.3. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11 1.3.1. Định nghĩa 11 1.3.2. Một số khái niệm cơ bản trong sắc ký 12 1.3.3. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng 13 1.3.4. Pha động trong sắc ký lỏng 14 1.3.5. Detector trong sắc ký lỏng 14 1.4. Thẩm định phương pháp phân tích 15 1.4.1. Tính đặc hiệu, chọn lọc. 15 1.4.2. Khoảng tuyến tính. 16 1.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) 16 1.4.4. Giới hạn định lượng (LOQ) 17 1.4.5. Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) 17 1.4.6. Độ thu hồi 18 1.4.7. Tính phù hợp của hệ thống 18 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Đối tượng, mục tiêu nghiên cứu. 19 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2. Mục tiêu nghiên cứu 19 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 19 2.2.2. Dụng cụ 19 2.2.3. Hóa chất 19 2.3. Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Lấy mẫu 20 2.3.2. Xử lý và tạo dẫn xuất mẫu 20 2.3.3. Xây dựng quy trình phân tích hydroxyprolin bằng phương pháp HPLC 22 2.3.4. Thẩm định quy trình HPLC 22 2.3.6. Đánh giá kết quả 22 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1. Tối ưu các điều kiện xác định collagen bằng phương pháp HPLC 23 3.1.1. Khảo sát quá trình thủy phân mẫu 23 3.1.2. Khảo sát điều kiện dẫn xuất 26 3.1.3. Khảo sát điều kiện phân tích HPLC. 29 3.2. Đánh giá phương pháp phân tích 34 3.2.1. Đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc 34 3.2.2. Xây dựng khoảng tuyến tính 36 3.2.3. Sự phù hợp hệ thống 37 3.2.4. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ) 37 3.2.5. Độ đúng 38 3.2.6. Độ lặp lại 40 3.3. Kết quả phân tích mẫu thực 41 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 435 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril ACQ 6-aminoquinolyl-N- hydroxy succinimidyl 6-aminoquinolyl-N- hydroxy succinimidyl DABS-Cl Dimethylaminoazobenzene Sulfonyl Chloride Dimethylaminoazobenzen Sulfonyl Chlorid FMOC Fluorenyl Methyloxycarbonyl Chloride HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IFIC International Food Information Council Hội đồng thông tin thực phẩm quốc tế ILSI International Life Science Institute Viện khoa học và đời sống quốc tế IUPAC International Union Of Pure And Applied Chemistry Liên minh Quốc tế về hóa học thuần túy và hóa học ứng dụng LC-MS/MS Liquid Chromatography tandem mass spectrometry Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng RSD Relative standard devition Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TEA Trietylamine Trietylamin TPCN Functional food Thực phẩm chức năng UV-VIS Ultraviolet - Visible Tử ngoại- khả kiến DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1. Một số phương pháp xác định collagen 8 Bảng 3. 1. Khảo sát nồng độ acid 23 Bảng 3. 2. Khảo sát nhiệt độ thủy phân 24 Bảng 3. 3. Khảo sát thời gian thủy phân 25 Bảng 3. 4. Khảo sát nhiệt độ dẫn xuất 27 Bảng 3. 5. Khảo sát thời gian dẫn xuất 28 Bảng 3. 6. Các điều kiện tối ưu thủy phân và tạo dẫn xuất mẫu 29 Bảng 3. 7. Các chế độ gradient 31 Bảng 3. 8. Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin. 36 Bảng 3. 9. Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống 37 Bảng 3. 10. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 38 Bảng 3. 11. Khảo sát độ thu hồi 39 Bảng 3. 12. Khảo sát độ chụm 40 Bảng 3. 13. Kết quả phân tích mẫu thực 41 DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1. Collagen: protein dạng sợi. 4 Hình 1. 2. Cấu trúc xoắn ba của collagen 4 Hình 1. 3. Hình ảnh ba bậc cấu trúc của collagen 5 Hình 1. 4. Một số chế phẩm có chứa collagen 7 Hình 1. 5. Cấu trúc phân tử hydroxyprolin 9 Hình 1. 6. Sơ đồ máy HPLC 11 Hình 1. 7. Quá trình sắc ký. 12 Hình 2. 1. Quy trình xử lý và tạo dẫn xuất mẫu 21 Hình 3. 1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hàm lượng collagen thu được vào nồng độ acid thủy phân 24 Hình 3. 2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm lượng collagen thu được vào nhiệt độ thủy phân 25 Hình 3. 3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ collagen thu được vào thời gian thủy phân 26 Hình 3. 4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được vào nhiệt độ dẫn xuất 27 Hình 3. 5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic thu được vào thời gian dẫn xuất 28 Hình 3. 6. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn detector với detector UV (A) và detector huỳnh quang (B) 30 Hình 3. 7. Sắc ký đồ của dung dịch hydroxyprolin thu được với chương trình gradient 1(A), 2(B), 3(C) và 4(D). 33 Hình 3. 8. Quy trình phân tích collagen trong chế phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC 34 Hình 3. 9. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu, chọn lọc 35 Hình 3. 10. Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ hydroxyprolin 36 1 LỜI NÓI ĐẦU Ngày nay, khi mức sống của con người không ngừng được cải thiện, nhu cầu nâng cao chất lượng cuộc sống ngày càng được quan tâm. Chăm sóc sức khỏe và làm đẹp là những nhu cầu như vậy, đặc biệt là đối với phụ nữ. Người ta bắt đầu tìm đến những dịch vụ, sản phẩm giúp chăm sóc sức khỏe và làm đẹp nhanh hơn, tốt hơn, tiện dụng hơn. Chính vì thế, thực phẩm chức năng (TPCN) là một trong những lựa chọn đầu tiên của nhiều người. Gần đây, một trong những thành phần hay được sử dụng trong nhiều nhóm sản phẩm khác nhau là collagen. Trong đó, nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng chứa collagen hiện đang lưu hành trên thị trường như Collagen Tây Thi, Nippi, My Vita Collagen,…. Collagen là một loại protein chiếm 70% cấu trúc da, phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, có vai trò quan trọng với sức khỏe, đặc biệt là với làn da, mạch máu, xương khớp, mắt [11] … Chính vì tác dụng rất lớn của collagen mà nhiều nhà sản xuất đã lạm dụng nó trong các sản phẩm của mình hoặc làm giả, làm nhái các sản phẩm có chứa collagen. Do vậy, cần phải có phương pháp phân tích phù hợp để xác định hàm lượng collagen trong các sản phẩm trên thị trường. Cho tới nay đã có khá nhiều phương pháp xác định collagen trong các đối tượng khác nhau như sắc ký lỏng hiệu năng cao các loại, tạo màu đo quang,…Tuy nhiên, mỗi phương pháp có những nhược điểm nhất định như quy trình xử lý phức tạp, dẫn xuất kéo dài, tốn kém, khó áp dụng vào điều kiện tại Việt Nam…Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định collagen trong một số chế phẩm thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC” nhằm đáp ứng được một phần những yêu cầu kiểm nghiệm. Mục tiêu của nghiên cứu: + Thiết lập quy trình định lượng hydroxyprolin thu được khi thủy phân collagen, qua đó xác định hàm lượng collagen trong TPCN. + Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng collagen trong một số mẫu TPCN. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về thực phẩm chức năng. 1.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng Hiện nay, vẫn chưa có một định nghĩa duy nhất nào của TPCN được công nhận trên toàn thế giới. Theo Viện khoa học và đời sống quốc tế (International Life Science Institute - ILSI) thì "thực phẩm chức năng là thực phẩm có lợi cho một hay nhiều hoạt động của cơ thể như cải thiện tình trạng sức khoẻ và làm giảm nguy cơ mắc bệnh hơn là so với giá trị dinh dưỡng mà nó mang lại". Theo IFIC, thực phẩm chức năng là những thực phẩm hay thành phần của chế độ ăn có thể đem lại lợi ích cho sức khoẻ nhiều hơn giá trị dinh dưỡng cơ bản [18] Theo định nghĩa của Hiệp hội thực phẩm chức năng Việt Nam thì: thực phẩm chức năng là thực phẩm (hay sản phẩm) có tác dụng hỗ trợ (phục hồi, duy trì hoặc tăng cường) chức năng của các bộ phận trong cơ thể, có hoặc không tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật. Bộ Y tế Việt Nam trong thông tư “Hướng dẫn quản lý sản phẩm thực phẩm chức năng” dự thảo 15 ngày 19/11/2012 định nghĩa “Thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của cơ thể con người, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng, giảm bớt nguy cơ mắc bệnh, bao gồm thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, thực phẩm dinh dưỡng y học”. Như vậy, có thể thấy có rất nhiều định nghĩa về thực phẩm chức năng nhưng nhìn chung đều có các đặc điểm chung: là thực phẩm hoặc sản phẩm dùng để hỗ trợ, phục hồi chức năng của các bộ phận trong cơ thể, giúp cơ thể tăng cường đề kháng, giảm bớt nguy cơ bệnh tật. 1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng Có nhiều cách để phân loại thực phẩm chức năng, cách phổ biến thường được sử dụng là phân loại theo tác dụng của chúng. Theo cách phân loại này thì thực phẩm chức năng bao gồm các nhóm sau: • Nhóm bổ sung vitamin và khoáng chất [...]... chính cho một số mỹ phẩm dùng qua da 7 Hình 1 4 Một số chế phẩm có chứa collagen 1.2.5 Các phương pháp xác định collagen Có nhiều phương pháp để xác định collagen Hướng phổ biến nhất là xác định collagen thông qua hydroxyprolin (mục 1.2.6 – Nguyên tắc xác định collagen thông qua hydroxyprolin), do đó để xác định collagen cần xác định được lượng hydroxyprolin Nguyên tắc chung là thủy phân collagen trong. .. cứu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định collagen trong một số mẫu thực phẩm chức năng Mẫu dùng trong nghiên cứu được lấy tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, là các thực phẩm chức năng dưới các dạng bột, viên nang cứng và dạng lỏng 2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu - Tối ưu hóa các điều kiện chạy máy HPLC để xác định collagen trong. .. điều kiện xử lý mẫu - Tối ưu hóa các điều kiện chạy máy HPLC để xác định collagen trong một số mẫu thực phẩm chức năng - Đánh giá (thẩm định) phương pháp phân tích - Ứng dụng phương pháp để xác định collagen trên một số mẫu thực tế 2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 2.2.1 Thiết bị - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC trang bị detector huỳnh quang - Cột sắc ký C18 Supelco (150 mm × 4,6 mm, 5µm) và... Nhóm thực phẩm chức năng “không béo”, “không đường”, “giảm năng lượng” • Nhóm các loại nước giải khát, tăng lực • Nhóm thực phẩm giàu chất xơ tiêu hóa • Nhóm các chất tăng cường chức năng đường ruột • Nhóm thực phẩm chức năng đặc biệt, bao gồm thức ăn cho phụ nữ có thai, người cao tuổi, vận động viên, phi hành gia, người đái đường, cao huyết áp,… 1.1.3 Quản lý thực phẩm chức năng Theo Thông tư quy định. .. quản lý thực phẩm chức năng của Bộ Y tế ban hành ngày 24/11/2014 [1], TPCN cần đạt các yêu cầu sau: + Công bố hợp quy và phù hợp quy định an toàn thực phẩm + Yêu cầu về báo cáo thử nghiệm hiệu quả về công dụng + Yêu cầu kiểm nghiệm + Yêu cầu đối với ghi nhãn thực phẩm chức năng + Quảng cáo thực phẩm chức năng TPCN cần đạt các yêu cầu về điều kiện sản xuất, kinh doanh và hướng dẫn sử dụng TPCN 1.2 Collagen. .. đối lớn, sử dụng LCMS/MS phải pha loãng nhiều dễ gây sai số, điều kiện trang thiết bị không sẵn có ở đa số phòng thí nghiệm, nên trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn phương pháp tạo dẫn xuất để phân tích trên hệ thống HPLC thông dụng với detector UV-VIS hoặc huỳnh quang 8 Bảng 1 1 Một số phương pháp xác định collagen STT Phương Đối tượng pháp phân tích Điều kiện phân tích Quy trình Làm thủy Tạo... hydroxyprolin trong mẫu: 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 ℎ𝑦𝑑𝑟𝑜𝑥𝑦𝑝𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛 = 𝐶′ × 𝑉 × 𝐾 (𝑚𝑔/𝑔) 𝑚 × 1000 Trong đó: m: khối lượng mẫu cân (g), V: thể tích định mức (mL) K: hệ số pha loãng Hàm lượng collagen: 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 𝑐𝑜𝑙𝑙𝑎𝑔𝑒𝑛 = 𝐻à𝑚 𝑙ượ𝑛𝑔 ℎ𝑦𝑑𝑟𝑜𝑥𝑦𝑝𝑟𝑜𝑙𝑖𝑛 × 7,46 (𝑚𝑔⁄ 𝑔) Trong đó 7,46 là hệ số chuyển đổi, đã trình bày trong phần tổng quan 23 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện xác định collagen bằng phương pháp HPLC. .. hydroxyprolin /collagen Hydroxyprolin là acid amin đặc trưng của collagen Hydroxyprolin không có trong bất kỳ một loại protein nào khác, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin Do đó, có thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyprolin Lượng hydroxyprolin có trong các chế phẩm collagen từ các nguồn động vật có vú đã được tìm thấy vào khoảng 13,4 ± 0,24% Hydroxyprolin có thể chuyển đổi tương đương sang collagen. .. - Trong công nghiệp thực phẩm: collagen được sử dụng như chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm, dùng làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, nguyên liệu sản xuất một số thực phẩm dinh dưỡng, Collagen hydrolysate được sử dụng nhằm ngăn chặn sự mất nước trong các sản phẩm phomat, tạo độ dẻo, dai, mềm trong kẹo dẻo; làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp trong kẹo mứt,… - Collagen được dùng thay thế cao... trưởng và các chất khác - Collagen có thể ứng dụng trong tái tạo mạch máu, tái sinh dây thần kinh ngoại biên 1.2.4.3 Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm Mỹ phẩm là một trong những ứng dụng quan trọng của collagen và do tính chất đặc biệt của lĩnh vực này, việc kiểm soát collagen trong các loại mỹ phẩm cần phải được thực hiện nghiêm ngặt - Collagen là một chất giữ ẩm tự nhiên hiệu quả do tác dụng hydrat . Giới thiệu về thực phẩm chức năng. 2 1.1.1. Khái niệm thực phẩm chức năng 2 1.1.2. Phân loại thực phẩm chức năng 2 1.1.3. Quản lý thực phẩm chức năng 3 1.2. Collagen. 3 1.2.1. Định nghĩa 3. 7 Hình 1. 4. Một số chế phẩm có chứa collagen 1.2.5. Các phương pháp xác định collagen Có nhiều phương pháp để xác định collagen. Hướng phổ biến nhất là xác định collagen thông qua. XÁC ĐỊNH COLLAGEN TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi 2. TS. Lê Thị Hồng Hảo Nơi thực