BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI — C 5 3 ★ B O — NGUYỄN THANH HUYỀN MỘT SỐ YẾU TỐ THƯỜNG GẶP TRONG KIỂM NGHIỆM • • • DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHÓA 2002-2007) Người hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian thực hiện : TS. Nguyễn Viết Thân : Bộ môn Dược Liệu : 09/2006 đến 05/2007 HÀ NỘI, THÁNG 05 NĂM 2007 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình hoàn thành khóa luận này tôi đã nhận được sự hướng dẫn và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ thầy cô và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Viết Thân Người thầy đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình làm thực nghiệm và hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo, kỹ thuật viên trong Bộ môn Dược liệu, các thầy cô trong Ban giám hiệu, Phòng đào tạo cùng toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Đồng thời tôi xin được cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2007 Sinh viên Nguyễn Thanh Huyền Trang Đặt vấn đề 1 Phần l:Tổng quan 3 1.1. Lịch sử phát triển của kiểm nghiệm dược liệu 3 1.2. Phân loại tạp 5 1.2.1. Côn trùng 6 1.2.2. Nấm mốc 7 1.2.3. Hạt phấn 10 1.2.4. Các yếu tố khác 11 Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 13 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 13 2.1.1. Nguyên liệu 13 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 13 2.2. Kết quả thực nghiệm 14 2.2.1. Hình ảnh các yếu tố tạp thường gặp trong kiểm nghiệm dược 14 liệu bằng kính hiển v i 2.2.2. Sơ bộ điều tra tạp trên dược liệu 41 2.2.3. Kiểm nghiệm mẫu tìiuốc có nguồn gốc từ dược liệu trên thị trường 44 Kết luận và đề xuất 45 Tài liêu tham khảo MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỂ Hiện nay trên thị trường đã và đang lưu hành ngày càng nhiều sản phẩm thuốc đông y được sản xuất theo phương thuốc cổ truyền. Tuy nhiên chất lượng của các loại thuốc này vẫn đang còn là câu hỏi lớn cho các nhà quản lý. Đảm bảo chất lượng của thuốc cần phải có sự kết hợp chặt chẽ trong các khâu từ kiểm tra nguyên liệu ban đầu, giám sát quy trình sản xuất, kiểm định thành phẩm, bán thành phẩm Do vậy việc kiểm tra dược liệu ban đầu là rất quan trọng. Như ta đã biết, mục đích của kiểm nghiệm dược liệu là xác định tính đúng và chất lượng của chúng. Tứih đúng và chất lượng của dược liệu cần phải được đánh giá thông qua sự kết hợp của các phương pháp: cảm quan, phương pháp hiển vi và hóa học. Từ xưa ông cha ta đã có câu: Tam đại lương y Bất vi hoàn tán Tức là dù rất giỏi (làm lương y đến 3 đời) nhưng vói loại thuốc bao gồm hỗn hợp các thành phần đã tán nhỏ thì cũng không cách nào nhận biết được. Tuy nhiên, sự rấ đòi của kính hiển vi và phương pháp kiểm nghiệm dược liệu bằng hiển vi đã làm thay đổi quan niệm này. Kiểm nghiệm bằng kính hiển vi có ưu điểm là không chỉ nhận biết được dược liệu đơn thành phần mà còn phát hiện được sự có mặt của dược liệu trong hỗn hợp. về nguyên tắc, phương pháp này được tiến hành sau khi kiểm nghiệm sơ bộ bằng cảm quan và trước khi áp dụng các phương pháp hóa học hay thử tác dụng sinh lý đối vói một dược liệu. Trong quá trình kiểm nghiệm bằng kính hiển vi, ta không chỉ thấy được đặc điểm đặc trưng để nhận biết dược liệu mà còn gặp những đặc điểm lạ có nguồn gốc khác nhau hay các yếu tố hữu hình như nấm mốc, côn trùng. Sự có mặt của những đặc điểm này có thể là dấu hiệu của lẫn tạp dược liệu hay dược liệu kém chất lượng. Các đặc điểm tìm thấy này nếu được nghiên cứu kỹ lưỡng có thể là những yếu tố rất quan trọng để đánh giá chất lượng dược liệu. Do đó để tạo cơ sở cho việc kiểm định dược liệu có hiệu quả hơn chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Một sô'yếu tố thường gặp trong kiểm nghiêm dược liệu bằng kính hiển Vỉ”. Mục đích của đề tài nhằm góp phần nâng cao hiệu quả kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi. Nội dung đề tài bao gồm: - Phát hiện các yếu tố thường gặp trong kiểm nghiệm dược liệu bằng kính hiển vi - Mô tả và nghiên cứu đặc điểm các yếu tố - Lập danh sách các yếu tố tạp trong 1 số dược liệu nhất định - Kdểm định một số mẫu thuốc trên thị trường PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Lịch sử phát triển của kiểm nghiệm dược liệu Từ thời xa xưa con người đã tìm cho mình thức ăn, vị thuốc trong cây cỏ và tập phân biệt cây độc. Đầu tiên các hiểu biết này được truyền miệng, sau được ghi lại, và trong các nền văn minh cổ xưa nhất còn tồn tại dấu tích dùng cây làm thuốc. Khối tri thức về dược liệu trên thế giới cứ thế dần phát triển, đáng chú ý là Teophorat viết cuốn lịch sử cây cỏ mô tả chính xác về thực vật, Dioscorid (người Hy Lạp) thống kê 500 vị dược liệu nguồn gốc thực vật, động vật và khoáng vật trong cuốn “Dược liệu học” (De Materia medica) [2], [17]. Khoảng đầu thế kỷ xvn, ngành dược liệu với nhiệm vụ là xác định, kiểm nghiệm dược liệu và chế phẩm được tách khỏi ngành y. Người ta bước vào giai đoạn khoa học dựa trên quan sát và thực nghiệm Cùng với tập lịch sử đại cương về dược liệu (1675) của Pome và quyển khảo luận phổ cập về dược liệu đơn (1697), người ta thu được kiến thức chính xác hơn về giới thực vật. Việc mô tả và phân loại dược vật được phát triển mạnh mẽ đặc biệt bởi các nhà khoa học Pháp. Các công trình này có ảnh hưcmg sâu sắc đến bộ môn dược liệu là xác định thực vật 1 cách chính xác, đây cũng chính là điểm xuất phát cơ bản của môn học này [17]. Đặc biệt, khi nhà khoa học Dragendorff tìm ra thuốc thử định túih alcaloid trong cây, kiểm nghiệm Dược liệu thực sự bước sang môt trang mới. Hóa học đã bắt đầu được đưa vào kiểm nghiệm dược liệu. Sau này, một hình thái mới của việc nghiên cứu được nảy nở vói sự phát triển của môn sinh lý. Tương quan giữa cấu trúc hóa học của các thành phần và tác dụng đã trở nên hiển nhiên vào cuối thế kỷ XIX. Như vậy, dần xuất hiện 3 mặt hoạt động của môn Dược Liệu: Kiểm nghiệm dược liệu bằng thực vật, nhiều khi đã đủ để xác định dược liệu, khảo sát thành phần hóa học và nhất là các hoạt chất, khảo sát tác dụng sinh lý là việc kiểm tra việc sử dụng trong điều trị. Môn dược liệu bắt đầu phát triển ở Việt Nam từ khi các nhà khoa học Pháp đưa môn này vào trong chương trình học ở trường Đại học Đông Dương. Nhờ đó ngành dược liệu của Việt Nam được kế thừa khối lượng tri thức của các nhà khoa học, thực vật học Pháp mà lúc này kiểm nghiệm bằng hiển vi đã đạt trình độ cao. Hơn nữa, Việt Nam có quan hệ thân thiết với các nước xã hội chủ nghĩa khác như Nga, Bungary, Hungary nên ngành Dược liệu nước ta cũng được kế thừa thành tựu khoa học của các nước này với kiểm nghiệm hóa học đã bắt đầu phát triển. Từ sau cách mạng tháng 8-1945 đến nay, nhà nước rất quan tâm đến việc phát triển Y học cổ truyền. Đặc biệt GS. TS. Đỗ Tất Lợi, tác giả cuốn “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, được coi như là cầu nối của Y Dược học hiện đại và Y Dược học dân tộc. * Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi: Đầu thế kỷ XX, môn Dược liệu được phát triển gần như chỉ theo hướng thực vật. Đầu tiên việc mô tả dược liệu đơn thuần chỉ là hình thái. Việc mô tả không đơn thuần đề cập đến các dược liệu mà còn nói đến giả mạo. Sau đó người ta đưa các đặc điểm vi học vào việc nhận thức và giám định [17]. Bao giờ phần này của môn Dược liệu cũng là cơ bản vì nếu không xác định thực vật một cách chính xác thì không có khảo sát hóa học và sinh lý cố giá trị [17]. Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là muốn kiểm định được dược liệu thì cần phải biết trước các dược liệu đó có đặc điểm gì. Nếu trong quá trình kiểm nghiểm có các đặc điểm lạ thì chúng bị coi là tạp. Được phát minh bởi nhà khoa học Leeuwenhoek vào thế kỷ xvn và bắt đầu được đưa vào sử dụng từ đầu thế kỷ xvni, kính hiển vi sau đó được áp dụng rộng rãi trong kiểm nghiệm dược liệu. Khi đó, các đặc điểm quan sát thấy được các nhà khoa học, thực vật học vẽ lại. Dù các hình ảnh này được vẽ tương đối tỉ mỉ và đã phần nào mô tả chính xác các đặc điểm nhưng chúng vẫn mang tính chất chủ quan và phụ thuộc nhiều vào người vẽ [11]. Ngày nay, do yêu cầu về độ chính xác ngày càng cao cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, máy ảnh đã được đưa vào sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu với mục đích chụp lại những hình ảnh quan sát được. Do vậy, hình ảnh thu được là hoàn toàn khách quan và chính xác. Hiện nay, máy ảnh được sử dụng dưới nhiều hình thức khác nhau như: máy kỹ thuật số gắn vào kính hiển vi, camera với một đầu được gắn với máy tính nhằm lưu lại ảnh chụp các đặc điểm dưới dạng file ảnh [14]. Khoa học kỹ thuật phát triển đã đưa vào sử dụng nhiều loại kính hiển vi khác nhau. Nếu trước đây các nhà khoa học chỉ sử dụng kính hiển vi sinh học trong kiểm nghiệm vi học, thì ngày nay nhiều loại kính khác đã được ứng dụng như kứứi hiển vi phân cực dùng để soi tinh thể dựa trên sự bất đẳng hướng về mặt quang học của chất, kứứi hiển vi so sánh nhằm so sánh các mẫu khác nhau về mô học hay hóa học, kính hiển vi điện tử giúp thu được hình ảnh không gian 3 chiều của đặc điểm hay yếu tố cần nghiên cứu. Ngoài ra, người ta còn sử dụng 1 hệ thống các kính hiển vi nối với nhau để chia sẻ hình ảnh hay chuyển hình ảnh từ kính hiển vi ra projector để phục vụ công tác giảng dạy [14]. 1.2. Phân ỉoại tạp Do có nguồn gốc từ thực vật và động vật nên dược liệu rất dễ bị nhiễm các loài nấm mốc, sâu bọ. Hơn nữa, trước khi đưa dược liệu vào kho bảo quản, dược liệu ttong quá trình thu hái, vận chuyển cũng không tránh khỏi khả năng bị lẫn tạp như bụi bẩn hay thành phần của các dược liệu khác. ĩQứ kiểm nghiệm một dược liệu bất kỳ bằng phương pháp hiển vi ta cần biết đặc điểm các yếu tố của dược liệu đó theo các tài liệu chính thống. Trong quá trình kiểm nghiệm nếu phát hiện có đặc điểm không thuộc về dược liệu thì đó là tạp. Các tài liệu phân chia tạp theo nhiều cách khác nhau, trong khóa luận này chúng tôi phân chia các yếu tố tạp trong dược liệu theo nguồn gốc: - Côn trùng (trứng, sâu non, nhộng, thành trùng). - Nấm mốc (cây nấm, bào tử, sợi nám). - Hạt phấn. - Các yếu tố khác: giọt dầu Parafin, vân kính. Như vậy, với khái niệm về tạp như trên, có những thành phần không phải lúc nào cũng là tạp. Ví dụ ở một số tài liệu phấn hoa trong mật ong (Mel) được coi là tạp, trong khi ở những tài liệu khác phỗứi hoa lại chúứi là đặc điểm của mật ong. 1.2.1. Côn trùng Dược liệu thường có tinh bột và các chất dinh dưỡng khác như Aavonoid, saponin Trong điều kiện bảo quản với nhiệt độ và độ ẩm thích hợp, dược liệu là môi trường sống của rất nhiều loại côn trùng. Do vậy, dược liệu bị nhiễm côn trùng là điều khó tránh khỏi. Khi soi bột dưới kính hiển vi, côn trùng có thể được phát hiện ở nhiều dạng khác nhau: nguyên dạng hay riêng lẻ từng bộ phận (chân, râu, đầu ), về cấu tạo, côn trùng có thân chia làm ba phần rõ ràng: đầu, ngực, bụng. Ngực chia làm 3 đốt, mỗi đốt có 1 đôi chân. Như vậy, từ “côn trùng” chỉ dùng để chỉ các loài động vật có 3 đôi chân (6 chân); còn một số loài bọ, mạt thường thấy trong thực phẩm hay dược liệu không được gọi là côn trùng vì chúng có 4 đôi chân, và thưòfng thuộc Ngành chân đốt (hay Ngành chân khớp), lớp nhện (hay lớp 8 chân). Song hầu hết các loài chân khớp nhiễm trong dược liệu thuộc lớp côn trùng]. Trong phạm vi khóa luận này, khái niệm “côn trùng” được dùng để chỉ những loài chân khớp thuộc lớp côn trùng (6 chân) và lớp nhện (8 chân) [1], [10], [13], [20]. Côn trùng là sâu hại của hầu hết các loại cây trồng. Theo thống kê chưa đầy đủ của Hội lương thực thực phẩm Quốc tế (FAO), hàng năm thiệt hại do sâu bệnh gây ra khoảng 83 triệu tấn lương thực. Điều này cho thấy sức tàn phá và số lượng đáng kể của côn trùng, đặc biệt trong môi trường thích hợp như kho lưcmg thực, thực phẩm. Dược liệu với các điều kiện bảo quản tương tự điều kiện bảo quản lương thực, thực phẩm cũng rất dễ bị côn trùng phá hoại [8], [13]. Trước hết cần tìm hiểu các yếu tố thuận lợi cho sự phát triển của côn trùng. Các yếu tố đó là: - Nhiệt độ Thân nhiệt côn trùng và trạng thái cơ thể của nó thay đổi theo sự thay đổi nhiệt độ bên ngoài. Khoảng nhiệt độ thuận lợi cho đa số côn trùng là 15°c đến 38°c, tối ưu là 26°c [9],[10], [13]. - Độ ẩm Côn trùng có kích thước nhỏ, diện tích bề mặt lớn, nên sự bốc hơi nước của cơ thể cũng lớn. Vì vậy, sự phát triển của côn trùng phụ thuộc rất nhiều vào độ ẩm của môi trường. Tùy từng loài mà độ ẩm không khí thích hợp có thể từ 40% đến 100% [9],[10], [13]. 1,2.2. Nấm mốc Tương tự côn trùng, nấm mốc rất dễ phát triển trên các loại dược liệu (cơ chất) khác nhau do điều kiện sinh sống (không khí, nước, ) gần với điều kiện bảo quản dược liệu. Việc nghiên cứu tìm ra các yếu tố bất lợi trong bảo quản dược liệu dẫn tới sự phát triển của nấm mốc rất quan trọng giúp hạn chế tối đa sự sinh trưởng của khuẩn ti nấm mốc. Các yếu tố bất lợi đó là: - Nhiệt độ Nhiệt độ có vai trò chủ yếu đối với sinh trưởng của khuẩn ti cũng như đối với sự hình thành và nảy mầm của bào tử. Đa số nấm mốc phát triển trong khoảng 15°c đến 30°c với nhiệt độ tối thích là 25°c đến 30°c [5], [12], [16]. [...]... 1 thể tích nhất định kiểm nghiệm trên kính hiển vi với bảng đếm trên vi trường Quan sát và đếm các đặc điểm lạ trên vi trường Số lượng các đặc điểm tìm thấy trên vi trường được coi như là tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu Khi kiểm nghiệm 1 dược liệu bất kỳ, kết quả tìm thấy được so sánh với số lượng đặc điểm tạp theo tiêu chuẩn Nếu số lượng đặc điểm tạp tìm thấy trong mẫu dược liệu nhiều hơn so với... mảnh dẻ, nhỏ, dài, hcd cong, như được mô tả trong tài liệu [4] ❖ Nhận xét- Bàn luận Các đặc điểm nấm tìm được trong dược liệu có thể rất khác nhau như bào tử nấm, sợi nấm Mặc dù dược liệu và các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu đã có tiêu thuẩn kiểm nghiệm bằng phương pháp vi sinh nhưng kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi vẫn cần có tiêu chuẩn kiểm nghiệm Đặc biệt phưoỉng pháp này còn giúp... ncd khác nhờ gió hay côn trùng, và do vậy rất dễ nhiễm vào các dược liệu khác Trong kiểm nghiệm các bộ phận dược liệu như rễ, thân, lá có thể bắt gặp hạt phấn của chính dược liệu đó hay dược liệu có nguồn gốc từ hoa khác nhiễm vào Điều này rõ ràng sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình kiểm nghiệm, đặc biệt với phương pháp kiểm nghiệm bằng kính hiển vi Đặc điểm chính để phân loại phấn hoa: a Hình khối hạt phấn:... các yếu tố tạp trong bột dược liệu + Quan sát và xác định màu sắc, mùi vị, bước đầu đánh giá về khả năng nhiễm tạp trong bột dược liệu bằng phương pháp cảm quan + Sử dụng nhiều loại dung dịch lên kính để làm tiêu bản bột dược liệu Nước là nguyên liệu được sử dụng chủ yếu để soi bột dược liệu Ngoài ra còn dùng ethanol và dung dịch NaOH 0,1N để soi rõ hơn các yếu tố tạp là nấm mốc Lấy bột dược liệu. .. 5: Một số bộ phận của côn trùng Hình 6: Một số bộ phận của côn trùng 22 Hình 7: Một số bộ phận của côn trùng Hình 8: Một số bộ phận của côn trùng 23 Hình 9: Chân côn trùng Hình 10: l.Đầu côn trùng; 2,3.Trứng côn trùng; 4,5.Nhộng 24 Hình 11: Một số đặc điểm lạ Hình 12: Một số đặc điểm lạ 25 Hình 13: Một số đặc điểm lạ Hình 14; Một số đặc điểm lạ 26 B.Nấm mốc Kết quả kiểm nghiệm cho thấy hầu hết các dược. .. biệt là vi n hoàn trong quá trình sản xuất thường bao bằng một lớp parafin ở ngoài, vừa để tạo độ bóng, tăng tính 11 thẩm mỹ của chế phẩm lại vừa có tác dụng bảo vệ Do vậy, trong quá trình kiểm nghiệm chế phẩm bằng kính hiển vi, các giọt dầu parafm thường xuyên được tìm thấy Điều này gây bất lợi trong quá trình kiểm nghiệm vì chúng có kích thước và hình dạng rất dễ nhầm lẫn với các yếu tố cẩn tìm trong. .. bản bằng nến trong: Dùng mũi mác lấy 1 lượng nến thích hợp cho lên lam kúứi, hơ phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn đến khi nến tan chảy hết và cho 1 ít bột dược liệu vào Dàn mỏng bột thật nhanh sau đó đậy lam lên và ép để tạo độ mỏng nhất định Tiêu bản để ở nhiệt độ thường cho nguội bớt trước khi đưa lên kính hiển vi để kiểm nghiệm 2.2 Kết quả thực nghiệm 2.2.1 Hỉnh ảnh các yếu tố tạp thường gặp trong kiểm. .. song chủ yếu là do chất liệu và cách thức sản xuất tạo nên đường vân kính gây ra khó khăn trong kiểm nghiệm 12 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu Mẫu nghiên cứu là dược liệu và các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu mua ở ngoài thị trường +Dược liệu mua tại các hiệu thuốc trên phố Hải Thượng Lãn ông +Các chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu mua... nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi Nói cách khác, chúng ta không chỉ định tính (phát hiện các yếu tố tạp) mà còn cần nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm ra phương pháp định lượng (xác định số lượng) các yếu tố tạp này trong một lượng dược liệu nhất định Chúng tôi bước đầu đề xuất kỹ thuật thiết lập tiêu chuẩn về tạp trong dược liệu như sau: Cân chính xác a (g) bột dược liệu, hoà vào b (ml) nước, tiếp... Các yếu tố khác Ngoài nhiệt độ và độ ẩm, yếu tố dinh dưỡng và một số các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển (sinh trưởng và sinh lý trao đổi chất) ở mốc Do đó, một số loài mốc chỉ phát triển tối thích trên một số loại cơ chất nhất định Hầu hết nấm mốc sống trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên mức độ không như nhau: các loài thuộc giống Mucor và Trichoderma đòi hỏi nồng độ O2 cao hơn, do đó thường . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI — C 5 3 ★ B O — NGUYỄN THANH HUYỀN MỘT SỐ YẾU TỐ THƯỜNG GẶP TRONG KIỂM NGHIỆM • • • DƯỢC LIỆU BẰNG KÍNH HIỂN VI (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC sĩ KHÓA 2002-2007) Người. rấ đòi của kính hiển vi và phương pháp kiểm nghiệm dược liệu bằng hiển vi đã làm thay đổi quan niệm này. Kiểm nghiệm bằng kính hiển vi có ưu điểm là không chỉ nhận biết được dược liệu đơn thành. thường gặp trong kiểm nghiệm dược liệu bằng kính hiển vi - Mô tả và nghiên cứu đặc điểm các yếu tố - Lập danh sách các yếu tố tạp trong 1 số dược liệu nhất định - Kdểm định một số mẫu thuốc trên