MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU Trâu là một loài động vật có vai trò kinh tế quan trọng ở một số nước châu Á và Địa Trung Hải, trong đó châu Á chiếm 95% sản phẩm từ trâu trên thế giới. Tuy nhiên so với một số ngành chăn nuôi khác như bò, lợn, gà thì chăn nuôi trâu vẫn chưa được quan tâm phát triển đúng mức. Tại Việt Nam, số lượng trâu đang có xu hướng giảm dần (Bảng 1 - Phụ lục). Chính vì thế việc nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh sản trên trâu nhằm nâng cao hiệu quả sinh sản của trâu là cần thiết. Nguồn trứng trâu sử dụng cho các nghiên cứu về công nghệ sinh sản ở trâu thường khá ít và thụ động. Việc tạo ra một nguồn trứng trâu có chất lượng tốt và chủ động là một giải pháp mà các nhà khoa học trên thế giới đang nghiên cứu và quan tâm. Bảo quản lạnh tế bào trứng được xem là một giải pháp hiệu quả cho vấn đề này. So với bảo quản lạnh tinh và phôi thì quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng kém hiệu quả hơn do sự khác nhau về cấu trúc tế bào. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng như: chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh, giai đoạn thành thục và chất lượng của trứng. Tại Việt Nam, trước đây có rất ít các nghiên cứu cơ bản về trâu, nhưng hiện nay do sự suy giảm về số lượng cũng như chất lượng đàn trâu nên các nhà khoa học đã quan tâm đến vấn đề ứng dụng công nghệ sinh học nhằm nâng cao khả năng sinh sản của đàn trâu. Luận án này được thực hiện trong điều kiện bảo quản lạnh tế bào trứng là một lĩnh vực nghiên cứu còn rất mới và ít được quan tâm ở Việt Nam, đặc biệt là đông lạnh tế bào trứng trâu. 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Đánh giá được ảnh hưởng của một số chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Đánh giá được ảnh hưởng của một số phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Đánh giá được ảnh hưởng của giai đoạn nuôi thành thục in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI A. Ý nghĩa khoa học - Lựa chọn được chất bảo vệ lạnh, phương pháp đông lạnh hiệu quả đối với quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng trâu. - Xác định được giai đoạn nuôi thành thục in vitro mang lại hiệu quả cao cho quá trình đông lạnh tế bào trứng. - Bước đầu tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông và tinh trùng đông lạnh. - Đưa ra được phương pháp bảo quản lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis) tại Việt Nam. 1 B. Ý nghĩa thực tế - Sự thành công trong việc bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis) đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học lạnh đối với việc bảo tồn các loài động vật nuôi có giá trị kinh tế cao, các loại động vật nuôi quý hiếm tại Việt Nam dưới dạng tế bào trứng đông lạnh. - Nguồn tế bào trứng trâu đông lạnh là nguồn nguyên liệu sử dụng cho các nghiên cứu khác về trâu như: tạo phôi trâu in vitro; tạo phôi trâu nhân bản bằng cấy chuyển gen, cấy chuyển nhân. 4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Lần đầu tiên tại Việt Nam đưa ra phương pháp đông lạnh thành công tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Lần đầu tiên tại Việt Nam tạo được phôi trâu in vitro từ tế bào trứng trâu (Bubalus bubalis) sau đông lạnh-giải đông. - Các kết quả nghiên cứu của luận án này có thể ứng dụng cho các phòng thí nghiệm về Công nghệ sinh sản trên toàn quốc. 5. BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN Luận án bao gồm 145 trang. Trong đó bao gồm: Mở đầu 4 trang; tổng quan 43 trang; vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 9 trang, kết quả và thảo luận 57 trang, kết luận và đề nghị 2 trang; các công trình đã công bố của luận án: 1 trang; tài liệu tham khảo 29 trang; phụ lục 2 trang. Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC Tổng quan tài liệu đề cấp đến 8 vấn đề chủ yếu sau: 1. Tế bào trứng trâu: cấu tạo tế bào trứng trâu; thu và phân loại chất lượng trứng trâu. 2. Môi trường nuôi thành thục in vitro tế bào trứng. 3. Quá trình thành thục nhân của tế bào trứng. 4. Chất bảo vệ lạnh sử dụng trong quá trình đông lạnh – giải đông tế bào trứng: các dạng chất bảo vệ lạnh, cơ chế hoạt động của chất bảo vệ lạnh, ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng, ảnh hưởng của thời gian và cách thức tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến tế bào trứng, quá trình giải đông và pha loãng. 5. Phương pháp đông lạnh sử dụng trong quá trình bảo quản lạnh tế bào trứng: đông lạnh chậm, thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, đông lạnh cực nhanh. 6. Ảnh hưởng của giai đoạn phát triển đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng: bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn túi mầm hoặc chưa thành thục, bảo quản lạnh tế bào trứng ở giai đoạn thành thục nhân (MII). 7. Một số dạng tổn thương lạnh của tế bào trứng trong quá trình bảo quản lạnh. 8. Đánh giá chất lượng tế bào trứng sau bảo quản lạnh: đánh giá dựa vào quan sát hình thái và nhuộm tế bào, đánh giá dựa vào khả năng phát triển tiếp theo của tế bào trứng. 2 Chương II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị nghiên cứu - Sử dụng tế bào trứng trâu có nguồn gốc từ buồng trứng lò mổ. - Sử dụng một số hóa chất của Sigma dùng cho đông lạnh tế bào trứng, nuôi thành thục in vitro tế bào trứng và tạo phôi trâu in vitro. - Sử dụng các thiết bị của Phòng TNTĐ – Viện Chăn nuôi, hệ thống kính hiển vi huỳnh quang của Bộ môn tế bào, mô phôi; Khoa Sinh học – Trường ĐH KHTN Hà Nội. 2.2. Nội dung nghiên cứu 1. Nghiên cứu số lượng, chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng ở lò mổ. 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro từ tế bào trứng trâu. 3. Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi thành thục in vitro khác nhau. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu. 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu. 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thu buồng trứng trâu Buồng trứng trâu thu từ lò mổ, được để trong dung dịch bảo quản buồng trứng, nhiệt độ 30 – 32 o C, đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-3 giờ. Rửa buồng trứng trâu trong dung dịch bảo quản buồng trứng vài lần ở nhiệt độ 30 – 32 o C trước khi sử dụng. 2.3.2. Phương pháp thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ Sử dụng phương pháp chọc hút để thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng lò mổ. 2.3.3. Phân loại tế bào trứng Phân loại tế bào trứng theo mô tả của Goodhand và cs. (2000). 2.3.4. Phương pháp nhuộm nhân xác định giai đoạn phát triển của nhân trứng trâu Loại bỏ lớp tế bào nang của tế bào trứng, cố định bằng Paraformaldehit 4% ở nhiệt độ phòng; tiếp theo rửa lại bằng PBS ba lần, ủ với RNAse nồng độ 10ug/ml trong 20 phút ở 37 o C hoặc nhiệt độ phòng, rửa lại bằng PBS và nhuộm với PI trong 15-20 phút tại nhiệt độ phòng, trong tối). Rửa lượng PI dư thừa bằng PBS. Quan sát, kiểm tra và xác định giai đoạn phát triển nhân tế bào trứng dưới kính hiển vi huỳnh quang. 2.3.5. Phương pháp nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu Tế bào trứng trâu được nuôi thành thục theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a). 2.3.6. Phương pháp đánh giá tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi in vitro Sử dụng cả hai phương pháp: quan sát hình thái và nhuộm nhân tế bào để đánh giá tế bào trứng thành thục sau nuôi in vitro. Với phương pháp quan sát hình thái, tế bào trứng được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng có khả năng thành thục là 3 trứng có các lớp tế bào nang bao xung quanh giãn nở, khối tế bào chất đồng đều chặt chẽ. 2.3.7. Phương pháp tạo phôi trâu in vitro 2.3.7.1. Hoạt hóa tinh trùng Quá trình hoạt hóa tinh trùng được thực hiện theo mô tả của Chauhan và cs. (1998a) với dung dịch gốc BO (Brackett và Oliphant, 1975). 2.3.7.2. Thụ tinh in vitro tế bào trứng trâu Tế bào trứng đã thành thục được chuyển vào giọt thụ tinh có chứa tinh trùng đã được hoạt hóa và được giữ 18 giờ ở điều kiện 38,5 o C; 5% CO 2 ; độ ẩm không khí bão hòa để tế bào trứng hoàn thành quá trình thụ tinh. 2.3.7.3. Nuôi phôi in vitro Trứng trâu sau thụ tinh in vitro sẽ được loại bỏ lớp tế bào nang bao xung quanh và chuyển vào giọt nuôi chứa môi trường nuôi phôi in vitro. Các giọt môi trường nuôi này sẽ được phủ dầu khoáng và giữ ở điều kiện 38,5 o C; 5% CO 2 ; độ ẩm không khí bão hòa. Kiểm tra, xác định tỷ lệ phân chia (thụ tinh) ở ngày thứ 2 sau thụ tinh, tỷ lệ phôi dâu, nang ở ngày thứ 8-9 sau thụ tinh. 2.3.8. Phương pháp đông lạnh tế bào trứng 2.3.8.1. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ truyền thống Các tế bào trứng trâu để trong dung dịch trước cân bằng một thời gian trước khi chuyển sang dung dịch đông lạnh. Tiếp theo khoảng 5-6 tế bào trứng sẽ được nạp vào cọng rạ 0,25ml, hàn kín đầu và để trên hơi nitơ lỏng. Sau 2 phút các cọng rạ này sẽ được nhúng ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng để bảo quản lâu dài. 2.3.8.2. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng trong cọng rạ hở Trứng trâu được để trong dung dịch pES một thời gian; sau đó chuyển sang môi trường VS, và nạp vào cọng rạ hở bằng lực mao dẫn. Các cọng rạ này sẽ được nhúng ngập trực tiếp vào trong nitơ lỏng mà không cần hàn kín. Để không bị nổi trong nitơ lỏng, các cọng rạ hở thường được cho vào trong cọng rạ 0,5ml không hàn kín. 2.3.8.3. Phương pháp thủy tinh hóa tế bào trứng bằng vi giọt Trong phương pháp thủy tinh hóa bằng vi giọt, trứng trâu cũng trải qua quá trình cân bằng trong dung dịch pES và dung dịch VS tương tự như phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống và cọng rạ hở. Tế bào trứng được hút bằng pipet pasteur (3-5 tế bào trứng/giọt) và thả trực tiếp vào trong nitơ lỏng. Các giọt dung dịch đông đặc có chứa mẫu sẽ được chuyển vào trong ống chịu lạnh và bảo quản trong nitơ lỏng. 2.3.9. Phương pháp giải đông tế bào trứng sau bảo quản lạnh Tế bào trứng được giải đông ở 37 o C, sau đó chuyển sang môi trường giải đông để loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh ra khỏi tế bào trứng. Tiếp theo các tế bào trứng sẽ được rửa 2-3 lần trong môi trường nuôi thành thục để loại bỏ hoàn toàn chất bảo vệ lạnh cũng như môi trường giải đông. 4 2.3.10. Phương pháp đánh giá hình thái tế bào trứng trâu sau đông lạnh-giải đông Trứng trâu thu được sau đông lạnh - giải đông sẽ được kiểm tra hình thái dưới kính hiển vi soi nổi. Trứng có hình thái bình thường nếu có hình cầu cân đối, không méo mó, lớp tế bào nang vẫn còn liên kết chặt chẽ với tế bào trứng, màng tế bào chất không bị tổn thương (không bị phồng lên hoặc xẹp xuống); tế bào chất không bị mất hoặc thoái hóa; màng sáng không bị đứt gãy. Trứng có hình thái không bình thường khi xuất hiện các biểu hiện như có hình dạng méo mó, lớp tế bào nang bao xung quanh bị tan rã, màng tế bào chất và màng sáng bị tổn thương, tế bào chất bị thoái hóa. 2.4. Thiết kế thí nghiệm Thí nghiệm 1: Nghiên cứu số lượng và chất lượng trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 1) - Trứng trâu sau khi thu từ buồng trứng lò mổ được phân loại dựa vào quan sát hình thái. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 2) Tế bào trứng trâu sau phân loại được nuôi thành thục in vitro trong 6 môi trường: TCM 199 + 10% FCS, TCM 199 + 5μg/ml FSH, TCM 199 + 10% FCS + 5μg/ml FSH, Ham’s F-10 + 10% FCS, Ham’s F-10 + 5μg/ml FSH, Ham’s F-10 + 10% FCS + 5μg/ml FSH. Sau nuôi thành thục, các tế bào trứng được thụ tinh in vitro và tạo phôi in vitro. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu giai đoạn phát triển của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 3 và 6) Xác định giai đoạn phát triển chủ yếu của nhân tế bào trứng trâu tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ) bằng phương pháp nhuộm nhân, kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Các chất bảo vệ lạnh (Ethylene glycol; Dimethylsulfoxide; 1,2 – Propanediol; Glycerol) được sử dụng kết hợp hoặc riêng lẻ ở cùng nồng độ 6M. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống. Dung dịch giải đông là: TCM 199. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Từ kết quả của thí nghiệm 4, lựa chọn dạng chất bảo vệ lạnh thích hợp sử dụng cho thí nghiệm 5. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước (thời gian tiếp xúc ở bước 1: 1 phút, bước 2: 30 giây). Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh đã lựa chọn ở thí nghiệm 4 với các nồng độ 2M, 4M, 6M và 8M. Dung dịch giải đông là TCM 199. Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc với chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Từ kết quả của thí nghiệm 5, dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 6. Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M 5 sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải đông là: TCM 199. Sử dụng phương pháp thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, tiếp xúc 2 bước. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 bằng ½ bước 1. Thời gian tiếp xúc ở bước 2 trong thí nghiệm này là 30 giây, 1 phút, 2 phút, 3 phút. Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc thêm sucrose trong quá trình giải đông đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 4) Từ kết quả của thí nghiệm 6, dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm 7. Dung dịch đông lạnh là: TCM 199 + 0,4% BSA + 0,5M sucrose + dạng chất bảo vệ lạnh với nồng độ đã được lựa chọn ở thí nghiệm 5. Dung dịch giải đông gồm hai dạng: dạng I là TCM 199; dạng II là hai dung dịch V1 (TCM 199 + 0,5M sucrose) và V2 (TCM 199 + 0,25M sucrose). Đối với dung dịch giải đông dạng I, tế bào trứng sau giải đông được để 5 phút trong dung dịch giải đông. Còn đối với dạng II: tế bào trứng sau giải đông được chuyển lần lượt vào dung dịch V1 và V2 mỗi lần 5 phút. Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 5) Sử dụng 3 phương pháp phổ biến bảo quản lạnh tế bào trứng hiện nay là: thủy tinh hóa trong cọng rạ truyền thống, thủy tinh hóa trong cọng rạ hở, thủy tinh hóa vi giọt. Nghiên cứu này sẽ xác định phương pháp thích hợp nhất với trứng trâu (trong điều kiện tại Việt Nam) khi sử dụng dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc và dung dịch giải đông thích hợp đã lựa chọn được từ các thí nghiệm 4, 5, 6 và 7. Thí nghiệm 9: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu (sử dụng cho nội dung nghiên cứu 6) Dạng chất bảo vệ lạnh ở nồng độ, thời gian tiếp xúc, dung dịch giải đông và phương pháp đông lạnh thích hợp đã xác định ở các thí nghiệm trước sẽ áp dụng trong thí nghiệm này. Các tế bào trứng trâu sẽ được đông lạnh ở các thời điểm nuôi in vitro khác nhau (0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ). 2.5. Phân tích số liệu và xử lý thống kê Số liệu của tất cả các nội dung nghiên cứu trong luận án này được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excell 2007, sự khác nhau có ý nghĩa được kiểm tra bằng χ 2 sử dụng hàm CHITEST, sự sai khác có ý nghĩa với P< 0,05. 2.6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm của luận án được tiến hành từ năm 2010 đến năm 2013 tại: - Phòng TNTĐ Công nghệ tế bào động vật – Viện Chăn nuôi. - Bộ môn Sinh học Tế bào, Khoa Sinh học – Trường ĐHKHTN, ĐHQG Hà Nội. 6 Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu tế bào trứng trâu từ buồng trứng ở lò mổ Bảng 2: Chất lượng tế bào trứng trâu thu từ buồng trứng lò mổ Số buồng trứng Số tế bào trứng thu được Số tế bào trứng thu được/buồng trứng (M ± SE) Số tế bào trứng loại A, B Số tế bào trứng loại A, B/buồng trứng (M ± SE) Số tế bào trứng loại C, D Số tế bào trứng loại C, D/buồng trứng (M ± SE) 565 2770 4,9 ± 0.36 1130 2 ± 0,2 1640 2,9 ± 0,33 Kết quả bảng 2 cho thấy trung bình thu được 4,9 tế bào trứng/buồng trứng trâu, trong đó 2 tế bào trứng tốt/buồng trứng. Kết quả này là thấp hơn so với một số gia súc khác như bò, lợn. Nguyên nhân là do: bản thân buồng trứng trâu có số lượng nang trứng nguyên thủy ít, tỷ lệ nang trứng nhỏ và kém chất lượng trên buồng trứng trâu cũng chiếm một tỷ lệ lớn (82 - 92%), tỷ lệ nang thoái hóa ở buồng trứng trâu cũng cao (70,6 - 82%), chất lượng trâu ở lò mổ, mùa thu buồng trứng, số lượng buồng trứng, kích thước và giai đoạn của chu kỳ buồng trứng và kỹ thuật thao tác của kỹ thuật viên. 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến hiệu quả tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu 3.2.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi đến sự thành thục in vitro tế bào trứng trâu Kết quả của nghiên cứu này cho thấy không có sự khác nhau (P>0,05) khi so sánh tỷ lệ thành thục giữa TCM 199 và Ham’s F-10 khi bổ sung riêng lẻ FCS và FSH (Bảng 3). Tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi, khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s F-10 và TCM 199 thì môi trường Ham’s F-10 cho tỷ lệ thành thục cao hơn so với TCM 199 (tương ứng là 74,64% và 63,28%; P<0,05). Thậm chí theo kết quả ở bảng 3, khi nuôi tế bào trứng trâu trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho tỷ lệ tế bào trứng trâu thành thục sau nuôi cao nhất (74,64%; P<0,05). Kết quả của nghiên cứu này cho thấy Ham’s F-10 nâng cao được hiệu quả nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu hơn TCM 199. 3.2.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục đến khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu Kết quả của nghiên cứu này cho thấy việc bổ sung riêng lẻ FSH vào môi trường TCM 199 và Ham’s F-10 cho tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FCS vào hai môi trường này (Bảng 4). Hiệu quả của việc tạo phôi trâu in vitro được nâng cao khi bổ sung kết hợp cả FSH và FCS vào môi trường Ham’s 7 F-10 và TCM 199. Tỷ lệ phân chia (tương ứng 78,26% và 65%); tạo phôi dâu, phôi nang (tương ứng 29,35% và 18,75%) trong môi trường nuôi có bổ sung kết hợp FSH và FCS cao hơn so với việc bổ sung riêng lẻ FSH, FCS (P<0,05; Bảng 4). Kết quả thể hiện ở bảng 4 cho thấy tỷ lệ phân chia; tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu được thành thục trong môi trường Ham’s F-10 + FCS + FSH là cao hơn so với các môi trường còn lại (tương ứng là 78,26%; 29,35%; P<0,05). Kết quả của chúng tôi cho thấy việc sử dụng môi trường Ham’s F-10 trong quá trình nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu mang lại hiệu quả tạo phôi trâu in vitro cao hơn so với môi trường TCM 199 ở cùng điều kiện. Kết quả của mục 3.2.1 và 3.2.2 đã chỉ ra rằng tế bào trứng trâu được nuôi thành thục in vitro trong môi trường Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho tỷ lệ thành thục, phân chia và tạo phôi hiệu quả hơn các môi trường còn lại. Với kết quả đó chúng tôi sử dụng môi trường nuôi thành thục in vitro Ham’s F-10 có bổ sung kết hợp FCS và FSH cho các thí nghiệm nuôi thành thục in vitro tế bào trứng trâu trong luận án này. Bảng 3: Tỷ lệ thành thục của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi khác nhau Môi trường Số tế bào trứng nuôi thành thục Tế bào trứng thành thục Số tế bào trứng % (M ± SE) TCM 199 + FCS 203 102 50,24 c ± 1,38 TCM 199 + FSH 200 103 51,5 c ± 1,47 TCM 199 + FCS + FSH 207 131 63,28 b ± 1,72 Ham F10 + FCS 213 108 50,7 c ± 1,39 Ham , s F10 + FSH 209 112 53,6 c ± 1,28 Ham , s F10 + FCS + FSH 209 156 74,64 a ± 1,76 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) 8 Bảng 4: Khả năng tạo phôi in vitro của tế bào trứng trâu sau khi nuôi in vitro trong một số môi trường nuôi thành thục khác nhau Môi trường Số tế bào trứng thụ tinh Tế bào trứng phân chia Phôi dâu, phôi nang Số tế bào trứng % (M ± SE) Số phôi dâu, phôi nang % (M ± SE) TCM 199 + FCS 123 51 41,46 c ± 1,36 10 8,13 c ± 1,55 TCM 199 + FSH 129 67 51,94 c ± 1,47 11 8,53 c ± 1,75 TCM 199 + FCS + FSH 160 104 65 b ± 0,9 30 18,75 b ± 0,93 Ham F10 + FCS 127 65 51,18 c ± 1,34 11 8,66 c ± 1,19 Ham F10 + FSH 138 94 68,12 b ± 1,12 25 18,12 b ± 1,41 Ham F10 + FCS + FSH 184 144 78,26 a ± 1,79 54 29,35 a ± 1,25 Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có chữ cái khác nhau là sai khác có ý nghĩa (P<0,05) 3.3. Trạng thái của nhân tế bào trứng trâu đầm lầy tại các thời gian nuôi in vitro khác nhau Kết quả nghiên cứu của luận án này cho thấy khi nhuộm nhân các tế bào trứng trâu loại A, B ngay sau khi thu từ buồng trứng lò mổ (tương ứng với thời gian nuôi in vitro 0 giờ) để kiểm tra, tất cả các tế bào trứng đều có nhân ở giai đoạn túi mầm (GV) (100%). Theo kết quả thu được trong nghiên cứu này thì tại thời điểm nuôi thành thục 9 12 giờ và 18 giờ, nhân tế bào trứng trâu chủ yếu tồn tại tương ứng ở kỳ giữa I (95,43%) và kỳ cuối I (64,57%). Đến thời điểm nuôi thành thục 24 giờ: 74,88% tế bào trứng có nhân đạt tới trạng thái thành thục và thể cực thứ nhất đã hình thành xong. Bảng 5: Trạng thái nhân tế bào trứng trâu ở các thời điểm nuôi khác nhau Thời gian nuôi in vitro Số tế bào trứng nuôi in vitro Số tế bào trứng trâu ở các giai đoạn phát triển nhân tại các thời điểm nuôi khác nhau % (M ±S E) Túi mầm Tiền kỳ giữa I Kỳ giữa I Kỳ sau I Kỳ cuối I Thành thục Thoái hóa 0 giờ 221 221 (100 ± 0) 6 giờ 218 216 1 1 (99,08 ± 0,79) 12 giờ 219 1 5 209 1 3 (95,43 ± 1,13) 18 giờ 223 1 6 11 59 144 2 (26,46 ± 1,12) (64,57 ± 1,41) 24 giờ 219 1 6 9 18 17 164 4 (8,22 ± 0,48) (7,76 ± 0,55) (74,88 ± 1,4) Sau 6 giờ nuôi thành thục in vitro tỷ lệ tế bào trứng có nhân ở giai đoạn GV vẫn rất cao (99,08%). Điều này cho thấy đối với tế bào trứng trâu thời gian tồn tại của nhân ở giai đoạn túi mầm là khá dài. Kết quả ở bảng 5 cho thấy tại mỗi thời điểm nuôi thành thục in vitro khác nhau, nhân tế bào trứng trâu tồn tại ở các trạng thái khác nhau, và đó có thể là nguyên nhân khiến tế bào trứng sẽ có mức độ chịu đựng những tổn thương lạnh khác nhau ở mỗi giai đoạn nuôi thành thục in vitro. 3.4. Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 3.4.1. Ảnh hưởng của dạng chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy EG là chất bảo vệ lạnh có ảnh hưởng tốt hơn so với DMSO, PROH, Gly kể cả khi sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp trong quá 10 [...]... bảo quản lạnh tế bào trứng trâu mà không ảnh hưởng tiêu cực đến tỷ lệ tạo phôi dâu, phôi nang của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông 3.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 3.6.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro tế bào trứng đến chất lượng tế bào trứng trâu sau đông lạnh – giải đông Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ tế bào. .. sucorose trong quá trình giải đông sẽ mang lại hiệu quả bảo quản lạnh tốt cho tế bào trứng trâu đầm lầy trong nghiên cứu này 3.5 Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 3.5.1 Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến số lượng tế bào trứng trâu thu được sau đông lạnh –giải đông Tỷ lệ tế bào trứng thu được sau đông lạnh- giải đông trong nghiên cứu của chúng tôi ở mỗi nhóm... nhân của tế bào trứng trâu chưa thành thục sau đông lạnh – giải đông 3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu Bảng 7: Sự thành thục in vitro của tế bào trứng trâu đầm lầy sau đông lạnh – giải đông ở các nồng độ EG khác nhau Chất bảo vệ lạnh Số tế bào trứng đông lạnh Tế bào trứng có hình thái bình thường sau đông lạnhgiải đông Số tế bào trứng Tế bào trứng thành... bảo vệ lạnh là Ethylene glycol để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy Bubalus bubalis Kết quả thể hiện ở bảng 7 Nồng độ chất bảo vệ lạnh sử dụng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng Tỷ lệ tế bào trứng trâu có hình thái bình thường thu được sau đông lạnh – giải đông cao nhất là ở nhóm EG 6M (70,04%; P . được ảnh hưởng của một số chất bảo vệ lạnh đến hiệu quả bảo quản lạnh tế bào trứng trâu đầm lầy (Bubalus bubalis). - Đánh giá được ảnh hưởng của một số phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế. tế bào trứng trâu. 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu. 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi in vitro đến hiệu quả đông lạnh trứng trâu. 2.3 đông sẽ mang lại hiệu quả bảo quản lạnh tốt cho tế bào trứng trâu đầm lầy trong nghiên cứu này. 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh đến hiệu quả đông lạnh tế bào trứng trâu 3.5.1. Ảnh hưởng