BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  BÙI THỊ THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TÍCH TỤ LIPID NỘI BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEP - G2 CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN NELUMBO NUCIFERA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  BÙI THỊ THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TÍCH TỤ LIPID NỘI BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEP - G2 CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN NELUMBO NUCIFERA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. ThS. Phạm Thái Hà Văn 2. ThS. Phí Thị Xuyến Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền 2. Khoa Dược lý – Sinh hóa Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới: Th.S Phạm Thái Hà Văn - giảng viên bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại Học Dược Hà Nội - người thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài. Th.S Phí Thị Xuyến, TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng - Cán bộ phòng Dược lý - Sinh hóa - Viện Dược liệu đã giúp đỡ em nhiều kiến thức bổ ích và những kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học. Em xin cảm ơn tập thể cán bộ phòng Dược lý - Sinh hóa - Viện Dược liệu đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài. Nhân dịp này, em cũng xin cảm ơn Ban Giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy cho em cũng như các bạn sinh viên trong trường trong suốt năm năm học tập. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ tạo đều kiện tốt nhất để em thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Thanh Hương MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 2 1.1. Cây Sen 2 1.1.1. Thành phần hóa học 2 1.1.2. Tác dụng dược lý 4 1.1.3. Công dụng 6 1.2. Bệnh béo phì, tế bào Hep - G2 sử dụng trong nghiên cứu béo phì, sự tích tụ lipid nội bào 8 1.2.1. Bệnh béo phì 8 1.2.2. Tế bào Hep - G2 sử dụng trong nghiên cứu béo phì 12 1.2.3. Sự tích tụ lipid nội bào 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1. Nguyên liệu, phương pháp xử lý nguyên liệu 15 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu 15 2.1.3. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 15 2.2. Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 16 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào 22 2.3. Xử lí số liệu 25 CHƢƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học 26 3.1.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 26 3.1.2. Sắc ký lớp mỏng 27 3.2. Nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào. 31 3.2.1. Đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu. 31 3.2.2. Nghiên cứu thăm dò nồng độ oleic 33 3.2.3. Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid 34 3.3. Bàn luận 36 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BMI : Body mass index DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO : Dimethylsulfoxid FFA : Free fat acid MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromid Oleic : Acid oleic ORO : Oil Red O PBS : Phosphat buffer salin SKLM : Sắc ký lớp mỏng TG : Triglycerid WHO : World heath organization DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Phân loại béo phì theo chỉ số BMI………………………….…… 8 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Sen………….… ……26 Bảng 3.2: Kết quả khai triển SKLM cao chiết cồn, hệ dung môi Cloroform: methanol: nước [50:7,5:1]………………………… ……………… …….28 Bảng 3.3: Kết quả khai triển SKLM cắn alcaloid và cao chiết cồn , hệ dung môi Cloroform: methanol: amoniac [50:9:1]……………………… ….… 29 Bảng 3.4: Kết quả khai triển SKLM cắn flavonoid và cao chiết cồn , hệ dung môi Cloroform: methanol: nước [7:4:1]………………….……….…… 31 Bảng 3.5: Kết quả đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu…….…32 Bảng 3.6: Kết quả thăm dò nồng độ oleic………………… ……… …….33 Bảng 3.7: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết nước …………………….……………………………… ………………… 34 Bảng 3.8:Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết cồn…………………………… …………………………………………….35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Sự tích tụ lipid ở mô mỡ………………………… ………….….14 Hình 3.1: Sắc ký đồ định tính cao chiết cồn, hệ dung môi Cloroform: methanol: nước [50:7,5:1]……………………………….………………… 27 Hình 3.2: Sắc ký đồ định tính cắn alcaloid và cao chiết cồn, hệ dung môi Cloroform: methanol: amoniac [50:9:1] …………….…………………. ….29 Hình 3.3: Sắc ký đồ định tính cắn flavonoid và cao chiết cồn, hệ dung môi Cloroform: methanol: nước [7:4:1]………………………………………….30 Hình 3.4: Kết quả đánh giá mức độ độc tế bào của mẫu nghiên cứu…… 32 Hình 3.5: Kết quả thăm dò nồng độ oleic ………………………… ………33 Hình3.6:Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết nước……………………………………………………………………….…34 Hình 3.7: Kết quả đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid của cao chiết cồn………………………………………………………………………… 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của đời sống xã hội tỉ lệ người dân mắc bệnh béo phì ngày càng gia tăng. Bệnh béo phì không chỉ ảnh hưởng đến thẩm mỹ, tâm lý mà còn ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Nó là nguyên nhân của các bệnh nguy hiểm như tim mạch, đái tháo đường, ung thư, rối loạn lipid máu. Theo một nghiên cứu của Kelly T. và cộng sự (2008), trên thế giới trong năm 2005 có 937 triệu người thừa cân và 396 triệu người béo phì, đến năm 2030 là 1,35 tỷ và 573 triệu người. Do đó, thừa cân và béo phì là một gánh nặng cho y tế và cộng đồng trên toàn thế giới. Phòng ngừa và điều trị các bệnh đi kèm và tử vong do thừa cân, béo phì phải được ưu tiên [35]. Từ lâu đã có nhiều thuốc điều trị béo phì ra đời, tuy nhiên ngoài tác dụng chính, các thuốc tân dược còn có nhiều tác dụng phụ, gây nhiều độc tính trên bệnh nhân [62]. Vì vậy, việc điều trị bằng các thuốc tân dược không phải là lựa chọn tốt nhất. Hiện nay, nghiên cứu các vị thuốc đông dược điều trị bệnh béo phì đang là một hướng có triển vọng. Ở Việt Nam, dân gian từ lâu đã sử dụng nhiều dược liệu trong các bài thuốc để giảm cân như chè xanh, cà phê, cát cánh. Lá cây Sen là một trong số những vị thuốc được sử dụng để hạ cholesterol máu và chữa bệnh béo phì hiệu quả. Mặc dù đã có một số nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học của lá Sen và tác dụng điều trị bệnh béo phì, nhưng vẫn chưa đầy đủ về mặt số lượng và chất lượng [2-6]. Do đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào trên dòng tế bào Hep - G2 của cao chiết từ lá cây Sen Nelumbo nucifera” .Với hai mục tiêu nghiên cứu sau:  Nghiên cứu thành phần hóa học của cao chiết từ lá cây Sen.  Nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào trên dòng tế bào Hep -G2 được gây tích tụ lipid bằng acid oleic của cao chiết từ lá cây Sen. 2 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN 1.1. Cây Sen Cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae ). Các bộ phận dùng làm thuốc: Hạt sen, tâm sen, tua sen, gương sen, lá sen, ngó sen, cuống sen, củ sen. 1.1.1. Thành phần hóa học Các thành phần hóa học trong cây được phân lập từ hạt, lá, hoa, thân rễ rất phong phú và đa dạng, bao gồm: alcaloid, steroid, triterpenoid, flavonoid, glycosid, polyphenol và các khoáng chất [67], [78]. 1.1.1.1. Thành phần hóa học của lá Sen Thành phần hóa học trong lá Sen bao gồm các nhóm chất như alcaloid, flavonoid, tanin, acid hữu cơ, saponin, đường tự do, sterol và nhóm chất màu. Trong đó alcaloid và flavonoid là hai thành phần chính và quan trọng nhất [22], [51], [67].  Nhóm chất alcaloid gồm: - Nhóm aporphin alcaloid: (–)-nuciferin, (–)-nornuciferin, (–)- asimilobin, (–)-N-methylasimilobin, (–)-caaverin, (–)-anonain và (–)- roemerin. - Nhóm oxoaporphin alcaloid: lysicamin và liriodenin. - Nhóm dioxoaporphin alcaloid: (–)-cepharadion B. - Nhóm dehydroaporphin alcaloid: (–)-7-hydroxydehydronuciferin. - Nhóm benzylisoquinolin alcaloid: (+)-1(R)-coclaurin và (–)-1(S)- norcoclaurin [22], [46], [51]. [...]... đánh giá: Lượng acid oleic tích tụ vào tế bào giữa hai nồng độ acid oleic 1mM và 0,5mM so với nhóm chứng Chọn nồng độ có lượng acid oleic tích tụ không quá cao 2.2.2.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào Nguyên tắc: Đánh giá khả năng ức chế tích tụ lipid với nồng độ mẫu nghiên cứu và nồng độ acid oleic đã chọn, so sánh với nhóm chứng Mức độ ức chế tích tụ lipid được đánh giá bởi... quanh các nội tạng Chức năng nội tiết của WAT là điều khiển sự thèm ăn, chuyển hóa năng lượng, chuyển hóa glucose và lipid, quá trình viêm, hình thành mạch, và các chức năng sinh sản Trọng tâm chính của đề tài này là tập trung vào sự tích tụ lipid ở tế bào mỡ 14 Hình 1.1: Sự tích tụ lipid ở tế bào mỡ TG được vận chuyển trong máu và bạch huyết từ ruột non về gan nhờ chylomicron và VLDL Ở tế bào nội mô... nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp nghiên cứu thành phần hóa học Nghiên cứu thành phần hóa học trong bộ phận lá Sen bằng phương pháp làm phản ứng hóa học phối hợp sử dụng sắc kí lớp mỏng, bao gồm: - Chiết xuất cao bằng ethanol 70o và làm phản ứng hóa học với cao từ lá cây Sen - Chiết lấy nhóm chất alcaloid, flavonoid để chạy sắc kí lớp mỏng bằng bản tráng sẵn trên đế nhôm 2.2.1.1 Phƣơng pháp chiết xuất Cao. .. Ngoài ra, một số nghiên cứu đã chứng minh được Hep - G2 còn có khả năng tích tụ lipid nội bào tốt nên dòng tế bào này được sử dụng rộng rãi trong các mô hình nghiên cứu về sự tích tụ lipid gây béo phì và ung thư gan [32], [33], [43], [56], [70], [75] 1.2.3 Sự tích tụ lipid nội bào Sự tích tụ lipid diễn ra ở tế bào mỡ Những tế bào mỡ trưởng thành tổng hợp và tiết ra một số enzyme, các yếu tố tăng trưởng... Trung Ương Mẫu lá tươi sau khi thu hái được đem sấy ở 80oC để diệt men, sau đó sấy ở nhiệt độ 60oC cho tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được nghiền thành bột, chiết nóng với nước và ethanol 2.1.2 Phƣơng tiện nghiên cứu Dòng tế bào Hep - G2 để thử độc tính và thử khả năng chống tích tụ lipid nội bào của cao chiết dược liệu 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị nghiên cứu Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu - Dụng cụ... sóng  = 254nm và 366nm Quan sát các vết trên bản sắc ký, so sánh các kết quả thu được từ 3 hệ dung môi, chọn ra hệ tách ra được nhiều vết và rõ nhất 22 2.2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào 2.2.2.1 Nuôi cấy tế bào in vitro Dòng tế bào Hep – G2 được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung (Penicilin + Streptomycin) (1:1) và huyết thanh thai bò 10% Tế bào được nuôi cấy... tử ngoại Camag - Buồng đếm tế bào - Kính hiển vi - Máy đo độ hấp thụ quang ELISA Hóa chất Hóa chất dùng để nghiên cứu thành phần hóa học là các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu, làm phản ứng hóa học và chạy SKLM đạt tiêu chuẩn thí nghiệm Hóa chất dùng để nghiên cứu tác dụng ức chế tích tụ lipid nội bào bao gồm: - Fenofibrat, acid oleic, ORO, DMSO (hãng Sigma) - Một số hóa chất khác như MTT, FBS,... các cao chiết khác nhau của thân rễ, hạt, lá, hoa và các hợp chất được phân lập từ các cao chiết đã được chứng minh qua nhiều mô hình thử nghiệm in vitro và in vivo [51] Bao gồm: 1.1.2.1 Tác dụng chống béo phì Có nhiều nghiên cứu các tác dụng của cao chiết từ lá cây Sen trên enzyme tiêu hóa, chuyển hóa lipid và tác động chống béo phì bằng cách sử dụng mô hình chuột mắc bệnh béo phì gây ra bởi một chế. .. dụng trên tim mạch Neferin, liensinin là hai alcaloid phân lập từ phôi hạt của hoa sen, đã được báo cáo là có tác dụng chống loạn nhịp trên nút xoang nhĩ của tim thỏ và các cụm tế bào cơ tim được nuôi cấy từ chuột sơ sinh Cơ chế của nó có thể liên quan đến ức chế không hoàn toàn kênh Ca++ và Na+ [42], [68] 1.1.2.5 Tác dụng hạ sốt Các cao chiết ethanol từ cuống của cây Sen được đánh giá là có khả năng. .. tế bào Hep – G2 nuôi cấy được tra với hai nồng độ oleic 1mM và 0,5mM Sau 24h mức độ tích tụ lipid được phát hiện bởi phương pháp nhộm với thuốc nhuộm Oil Red O Oil Red O là thuốc nhuộm lipid, nó chỉ hòa tan trong isopropanol và tạo màu đỏ Đo độ hấp thụ quang, độ hấp thụ tỉ lệ thuận với độ tích tụ lipid Tiến hành: Tế bào được nuôi cấy vào đĩa 24 giếng với mật độ 100.000 tế bào/ giếng (500µl), để tế bào . thành phần hóa học của cao chiết từ lá cây Sen.  Nghiên cứu khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào trên dòng tế bào Hep -G2 được gây tích tụ lipid bằng acid oleic của cao chiết từ lá cây Sen. . Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng ức chế tích tụ lipid nội bào trên dòng tế bào Hep - G2 của cao chiết từ lá cây Sen Nelumbo nucifera .Với hai mục tiêu nghiên cứu sau:  Nghiên cứu thành. Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  BÙI THỊ THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TÍCH TỤ LIPID NỘI BÀO TRÊN DÒNG TẾ BÀO HEP - G2 CỦA CAO CHIẾT TỪ LÁ CÂY SEN