B Y T I HC HÀ NI NGUYN TH DUYÊN NGHIÊN CU SINH TNG HP KHÁNG SINH T STREPTOMYCES 184.213 KHÓA LUN TT NGHI ng dn: Ths. T Thu Lan thc hin: B môn Vi sinh- Sinh hc HÀ NI - 2015 Li c Tôi xin trân trng gi li cc n ThS. T Thu Lan  cô giáo c ting dn tôi thc hin và hoàn thành khóa lun này. Tôi xin chân thành cy, cô giáo, các cán b, k thung dy, công tác ti b môn Vi sinh- Sinh hc, b môn Công nghic, Vin v sinh dch t i hc quc gia Hà Nn tình giúp  tôi trong quá trình hoàn thành khóa lun này. ng xin gi li ci Ban giám hiu, cùng toàn th các thy, cô giáo, cán b i hc Hà Nn tình truyn t kin thc và tu kin thun li cho tôi trong quá trình hc tp nghiên cu tng. Tôi xin gi li cng viên tôi trong sut thi gian thc hin khóa lun. Do thi gian thc hin khóa lun có h ca bn thân còn hn ch nên khóa lun này còn nhiu thiu sót. Tôi rt mong nhc nhng ý ki góp ca các thy cô và các b khóa luc hoàn thi Tôi xin chân thành c Hà Ni ngày 9  Sinh viên Nguyn Th Duyên MC LC T V 1 NG QUAN 2 1.1.  kháng sinh 2 1.1.1. c s nghiên cu kháng sinh 2 1.1.2.  2 1.1.3. Phân loi kháng sinh 3 1.1.4. Các ng dng ca kháng sinh 4 1.1.5.  tng quát sinh tng hp kháng sinh 5 1.2.  x khun. 6 1.2.1. Phân loi và phân b ca x khun trong t nhiên 6 1.2.2. m hình thái ca x khun 6 1.2.3. m x khun chi Streptomyces 7 1.3. Mt s p VSV sinh kháng sinh: 8 1.3.1. y dch chit lên b mt thch: 8 1.3.2. t trc tip lên b mt tha sn VSV kinh : 8 1.3.3. t: 8 1.3.4. ng phân lp: 9 1.4. Tuyn chn, ci to và bo qun ging x khun. 9 1.4.1. Chn chng có HTKS cao bng sàng lc ngu nhiên: 9 1.4.2. t bin ci to ging 9 1.4.3. Bo qun ging x khun 9 1.5. Lên men sinh tng hp kháng sinh 10 1.5.1. Bn cht ca quá trình lên men. 10 1.5.2. Nhân ging VSV 10 1.5.3.  11 1.6. Chit tách và tinh ch kháng sinh t dch lên men. 12 1.6.1. t xut 12 1.6.2.  13 1.6.3. Tinh ch kháng sinh 13 1.7. nh cu trúc kháng sinh. 13 1.7.1. Ph t ngoi- kh kin. 13 1.7.2. Ph hng ngoi 13 1.7.3. Khi ph MS 14 1.8. Mt s nghiên cu g 14 1.8.1. Sn xut kháng sinh t Streptomyces sannanensis SU118 14 1.8.2. Phân lp, th nghim, tách các thành phn kháng sinh t Streptomyces sp. SCA7. 15 U 15 2.1. Nguyên vt liu và thit b 15 2.1.1. liu 15 2.1.2. Máy móc thit b 18 2.2. Ni dung nghiên cu 19 2.2.1. nh hình thái ca Streptomyces 184.213 19 2.2.2. Chn lc, ci to ging 19 2.2.3.  19 2.2.4.  20 2.3. Tin hành thc nghim 20 2.3.1.  20 2.3.2.  nh hình thái x khun theo ISP 20 2.3.3.  20 2.3.4. ng nuôi cy thích hp 21 2.3.5.  22 2.3.6.  22 2.3.7.  23 2.3.8.  bn nhi bn pH ca dch 24 2.3.8.1.  bn nhit 24 2.3.8.2.  bn pH 24 2.3.9. t kháng sinh t dch lc bng dung môi h 24 2.3.10.  24 2.3.11.  25 2.3.12.  25 2.3.13.  26  27 3.1. Streptomyces 184.213 27 3.2.  27 3.3. Kt qu th HTKS sau SLNN 28 3.4.  28 3.5. Kt qu t bin ci to ging ln 2 29 3.6. Chn MT lên men chìm 30 3.7. Kt qu chn chng lên men 30 3.8. Kt qu ng ca pH và nhi  bn 31 3.9. Kt qu chn dung môi chit sut kháng sinh 32 3.10. Kt qu sc ký lp mng chn h dung môi 33 3.11. Kt qu sc ký ct ln 1 34 3.12. Kt qu SKLM chn h DM ln 2 35 3.13.  36 3.14. Kt qu  nh kháng sinh tinh khic. 37 3.14.1.  37 3.14.2.  37 3.14.3.  38 KT LUN VÀ KIN NGH 39 2. Kin ngh 39 TÀI LIU THAM KHO 41 DANH MC CÁC KÝ HIU, CH VIT TT ISP International Streptomyces Project ADN - deoxyribonucleic CW Cell wall (Thành t bào) DM Dung môi DMHC Dung môi h  t bin Gr Gram Gr (+)  Gr (-) Gram âm HTKS Hot tính kháng sinh IR Infrared (Hng ngoi) L-DAP L-diaminopimelat acid MS Mass spectrometry (Ph khi) ng MTdt ng dch th P. mirabilis Proteus mirabilis B.subtilis Bacillus subtilis RAPD Random amplified polymorphic DNA i ngu nhiên) SLNN Sàng lc ngu nhiên TK Tinh khit UV Ultraviolet (T ngoi) VK Vi khun VSV Vi sinh vt DANH MC CÁC BNG   .1  2.2  2.3  2.4  dng 3.1 m hình thái Streptomyces 184.213  Kt qu th HTKS chng nuôi cy thích hp 3.3 Kt qu th HTKS sau sàng lc ngu nhiên 3.4  3.5  3.6  3.7  3.8  3.9  3.10  3.11  3.12  3.13  DANH MC CÁC HÌNH V Tên hình Ni dung Hình 1.1  tng quát lên men sn xut kháng sinh. Hình 1.2 Các loi khun ty  x khun. Hình 1.3                 8      1 T V Cùng vi s phát trin v vi sinh vt hc, s phát minh u tiên là p0 tr c ngot lch s m ra k nguyên mi trong c y hc. T  sn xuc khai sinh và ng dng mnh m u tr bi. Mc dù thành công vang di trong vic tìm ra kháng sinh và s ci tin trong quá trình sn xu bnh lý nhim trùng vn là nguyên nhân th hai dn t vong trên toàn th gii và nhim trùng do vi khun gây ra xp x 17 triu ca t vong h yu trên tr i già. Vic t ý s dng và lm dng kháng sinh là mt yu t quan trng tc nghiên cu và phát trin các kháng sinh mi có hiu qu cao, ít b c tính th thành nhu cu tt yi vi nn y hc th gii, trong t Nam- mt quhát trin có t l nhi l kháng kháng sinh rt cao. Hin nay khong 80% các lo   c sinh tng hp t Streptomyces. ng khí hu kin cho nhiu loi vi sinh vt phát trit nhiu x khuc bit là x khun thuc chi Streptomyces. Vi thc trc ta hin nay nhu cu s dng kháng sinh rt ln  ngành công nghip sn xun, hu ht kháng sinh trên th ng là nhp khu( dng thành phm hoc bán thành phm). ng nghiên cu tìm ra kháng sinh mi t n xuu tr u sinh tng hp kháng sinh t Streptomyces n vi các mc tiêu sau:  Chn lc, ci to gi nâng cao hiu sut sinh tng hp kháng sinh.  u kin t lên men, chit tách kháng sinh.     nh mt s tính cht lý, hóa c    c. [...]... kháng sinh Đã có rất nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh Tuy nhiên, ngày nay với sự phát triển của khoa học, ngƣời ta có thể tổng hợp hoặc bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên( chloramphenicol), tổng hợp nhân tạo các chất có hoạt tính kháng sinh ( sulfamid, quinolon)- nên định nghĩa về kháng sinh trong y học hiện đại đã đƣợc mở rộng Tóm lại, hiện nay kháng sinh đƣợc định nghĩa nhƣ sau :Kháng sinh. .. xạ khuẩn đƣợc phân lập từ tự nhiên có tiềm năng lớn trong việc sinh tổng hợp kháng sinh, góp phần thúc đấy tìm ra kháng sinh mới 1.8.2 Phân lập, thử nghiệm, tách các thành phần kháng sinh từ Streptomyces sp SCA7 [21] 37 chủng xạ khuẩn đã đƣợc phân lập từ mẫu đất phân lập từ 1 cánh đồng ở Vengodu, Thiruvannamalai, Tamil Nadu, Ấn độ Các chủng này đƣợc đáng giá hoạt tính kháng sinh trên 5 vi khuẩn Gr(+)... nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh: kháng sinh diệt khuẩn , kháng sinh kìm khuẩn  Phân loại theo cơ chế tác dụng: Ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn, ức chế tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic, ức chế chuyển hóa, thay đổi tính thấm của màng tế bào  Phân loại theo cấu trúc hóa học : Đây là cách phân loại khoa học nhất vì nó đƣợc sử dụng phổ biến Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học... nhận đƣợc từ VSV hay các nguồn khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọ lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa ) hay tế bào ung thƣ ở nồng độ thấp [4,10] 1.1.3 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách khác nhau để phân loại kháng sinh :  Phân loại theo nguồn gốc : Kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, kháng sinh có nguồn gốc bán tổng hợp, tổng hợp  Phân... bông… 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Bƣớc đầu xác định hình thái của Streptomyces 184. 213 Sơ bộ xác định đặc điểm hình thái của Streptomyces 184. 213 2.2.2 Chọn lọc, cải tạo giống  Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 184. 213  Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất,  Đột biến bằng ánh sáng UV để nâng cao hoạt t nh của Streptomyces 184. 213 2.2.3 Lên men, chiết... tinh chế kháng sinh  Từ 3 MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất, chọn một MT lên men chìm tốt nhất  Từ các dạng chủng và biến chủng thu đƣợc, lựa chọn chủng (biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất 20  Tìm hệ DM khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất  Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết DM hữu cơ 2.2.4 Sơ bộ xác định một số t nh chất và cấu tr c của kháng sinh thu đƣợc... việc kháng sinh đi vào môi trƣờng nhiều hay tích tụ ở sinh khối 13  Ly tâm: là phƣơng pháp tách các chất có khối lƣợng riêng khác nhau, thƣờng là tách pha rắn kh i pha l ng nhờ lực ly tâm 1.6.2 Các phƣơng pháp tách kháng sinh Trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh, phƣơng pháp sắc k đƣợc sử dụng để tách sản phẩm Các phƣơng pháp sắc k thƣờng đƣợc dùng:  Sắc ký lớp m ng: tách các chất trong hỗn hợp. .. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Giống xạ khuẩn truyền ủ trong phòng thí nghiệm nghiệmnghiệm nghiệm Bình nhân giống quy mô thí nghiệm Nhân giống trong thiết bị nhân giống Lên men tổng hợp kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Lọc, ly tâm Dịch chiết sinh khối Dịch chiết Cô, tinh chế Sản phẩm tinh chế Kiển nghiệm Sản phẩm đã đƣợc kiểm nghiệm Đóng gói Sản phẩm đóng gói Hình 1.1: Sơ đồ tổng. .. 1951-1952 Tiếp theo năm 1968, một đơn vị nghiên cứu kháng sinh ở trƣờng Đại học Dƣợc khoa Hà Nội đã đƣợc thành lập do GS Trƣơng Công Quyền phụ trách Tại đây đã phân lập đƣợc hàng nghìn chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất khác nhau Từ năm 1974, tại Viện Khoa học Việt Nam ( nay là Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) đã có một nhóm nghiên cứu về kháng sinh Nhiều chủng VSV cho kháng sinh có hoạt tính mạnh đƣợc ứng... giờ, mang ra quan sát Nếu xung quanh các hạt đất có vòng vô khuẩn, ta biết đƣợc trong VSV trong hạt đất có sinh ra kháng sinh chống lại VSV kiểm định Từ hạt đất đó ta tiến hành phân lập VSV sinh kháng sinh để nghiên cứu tiếp 1.3.3 Phƣơng pháp làm giàu đất: Đất trƣớc khi đem phân lập VSV sinh kháng sinh đƣợc đƣa vào chậu thủy tinh, giữ độ ẩm xác định- thỉnh thoảng ta lại cho them một ít VSV kiểm định vào, . TH DUYÊN NGHIÊN CU SINH TNG HP KHÁNG SINH T STREPTOMYCES 184. 213 KHÓA LUN TT NGHI ng dn: Ths. T Thu Lan thc hin: B môn Vi sinh- Sinh hc . loi kháng sinh :  Phân loi theo ngun gc : Kháng sinh có ngun gc t nhiên, kháng sinh có ngun gc bán tng hp, tng hp.  Phân loi theo tính nhy cm ca vi khun vi kháng sinh: kháng. thành phm). ng nghiên cu tìm ra kháng sinh mi t n xuu tr u sinh tng hp kháng sinh t Streptomyces n