BỘ Y TẾ TRƯNG ĐI HC DƯC H NỘI NGUYỄN TIẾN TUẤN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES 184.223 KHA LUN TT NGHIP DƯC S H NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯNG ĐI HC DƯC H NỘI NGUYỄN TIẾN TUẤN NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES 184.223 KHA LUN TT NGHIP DƯC S Ngưi hưng dẫn: PGS.TS Cao Văn Thu Nơi thc hin: B môn Vi sinh & Sinh hc Trưng Đại hc Dưc H Ni H NỘI – 2015 LI CẢM ƠN Với sự biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo giúp đỡ tận tình để giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa hóa trường đại học khoa học tự nhiên Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã chỉ dạy, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Đồng thời tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận. Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Tiến Tuấn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1.Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2.Phân loại kháng sinh 2 1.1.3.Cơ chế kháng sinh 2 1.1.4.Các phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh 2 1.2. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 3 1.3. Phương pháp phân lập VSV sinh kháng sinh 5 1.4. Cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 5 1.5. Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 7 1.6. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 8 1.7. Sơ lược các phương pháp xác định cấu trúc của kháng sinh. 9 1.8. Sản xuất 8- demethylgeldanamycin và 4,5- epoxy-8 demethylgeldanamycin có tác dụng điều trị ung thư vú từ Streptomyces hygroscopicus 10 1.9. Sinh tổng hp các chất tương tự geldanamycin để ức chế Hsp90. 10 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1. Đối tượng nghiên cứu 11 2.1.1 Giống xạ khuẩn 11 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 11 2.1. 3 Môi trưng nuôi cấy 11 2.1.4 Dụng cụ và hóa chất 14 2.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 184.223 14 2.2.2 Chọn lọc và cải tạo giống 14 2.2.3 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 14 2.2.4 Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 15 2.3. Phương pháp thc nghim 15 CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT 21 3.1.Kết quả chọn môi trưng nuôi cấy thích hợp và VSV kiểm định 22 3.2.Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên chủng Streptomyces 184.223 23 3.3.Kết quả đột biến UV lần 1 24 3.4.Kết quả đột biến UV lần 2 25 3.5.Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhit độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 25 3.6.Kết quả chọn dung môi chiết suất kháng sinh. 27 3.7.Một số đặc điểm của Streptomyces 184.223 28 3.8.Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 29 3.9.Kết quả sắc ký lp mỏng chọn h dung môi 30 3.10.Kết quả sắc ký cột 31 3.11.Kết quả đo phổ IR, phổ UV, khối phổ MS và xác định sơ bộ các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được 36 1.Kết luận 37 2.Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC. DANH MỤC KÝ HIU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT ADN Acid 2'- deoxyribonucleic B.cereus Bacillus cereus DM Dung môi DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project ( chương trình Streptomyces quốc tế) KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể P.mirabilis Proteus mirabilis s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên TB Tế bào UV Ultra violet ( tử ngoại) V Thể tích VSV Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học . 2 Bảng 1.2. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2 Bảng 2.1. Các vi sinh vật kiểm định 11 Bảng 2.2. Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml). 12 Bảng 2.3. Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 12 Bảng 2.4. Các dung môi sử dụng 13 Bảng 3.1. Kết quả HTKS của bào tử Streptomyces 184.223 trên các MT 22 Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 23 Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS đột biến lần 1. 24 Bảng 3.4. Kết quả thử HTKS đột biến lần 2. 25 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. 26 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và 5 ngày. 26 Bảng 3.7. Kết quả HTKS pha DM và nước của 5 DMHC ở 5 pH 27 Bảng 3.8. Các đặc điểm phân loại của Streptomyces 184.223 theo ISP 29 Bảng 3.9. Kết quả HTKS chọn môi trường lên men 29 Bảng 3.10. HTKS dịch lên men của các dạng chủng và biến chủng trên MT2dt 30 Bảng 3.11. Kết quả sắc ký lớp mỏng chọn hệ dung môi 31 Bảng 3.12. Kết quả thử HTKS các PĐ sắc ký cột lần 1 với hệ dung môi 3 32 Bảng 3.13. Kết quả SKLM các phân đoạn của sắc ký cột lần 1……………………33 Bảng 3.14. Kết quả SKLM dò hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2…………………34 Bảng 3.15. Kết quả chạy sắc ký cột lần 2 với hệ DM Ethylacetat: Methanol (40:1).34 Bảng 3.16. Kết quả chạy sắc ký cột lần 3 với hệ DM Ethylacetat: Methanol (40:1).35 PHỤ LỤC Hình P.0 Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh. Hình P.1 Đĩa Petri chứa xạ khuẩn Streptomyces 184.223 sau 6 ngày nuôi cấy. Hình P.2 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp khối thạch. Hình P.3 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp giếng thạch. Hình P.4 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 184.223 bằng phương pháp khoanh giấy lọc. Hình P.5 Kết quả chạy SKLM (hệ 40:1) phân đoạn chính sau khi chạy sắc kí cột và sắc kí cột. Hình P.6 Hình dạng chuỗi bào tử (a) và bề mặt bào tử (b) của Streptomyces 184.223 Hình P.7 Phổ tử ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.223. Hình P.8 Phổ hồng ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.223 Hình P.9 Phổ khối lượng vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184.223 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh là nhóm thuốc có hiệu quả cao trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Nhờ tìm ra kháng sinh mà hàng loạt căn bệnh từng đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe và tính mạng loài người như các chứng viêm nhiễm, nhiễm khuẩn như lao, viêm phổi được điều trị và khống chế có hiệu quả. Nhưng đáng tiếc là trước hiệu quả điều trị rất rõ ràng, hầu hết các bệnh nhân và nhiều thầy thuốc cũng đã lạm dụng kháng sinh, coi đây như thần dược. Thực tế không như vậy, đối với các trường hợp viêm nhiễm do virus và bệnh cúm, viêm não B… thì kháng sinh hầu như không có hiệu quả. Hiện nay, sử dụng kháng sinh không đúng cách dẫn đến xuất hiện tình trạng kháng thuốc của các vi sinh vật gây bệnh với nhiều cơ chế phức tạp. Vì vậy việc tìm ra kháng sinh mới ít độc tính, điều trị hiệu quả là rất cần thiết. Trong đó con đường truyền thống sàng lọc tìm kiếm kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật vẫn là con đường quan trọng trong việc phát hiện ra các chủng mới có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt, đồng thời tìm ra các hoạt chất mới có khả năng ức chế vi khuẩn kháng thuốc. Chi Streptomyces là một chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Do vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 184.223 ” với các mục tiêu sau:  Tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao từ chủng giống Streptomyces 184.223  Bước đầu nghiên cứu hình thái Streptomyces 184.223 theo ISP.  Nghiên cứu điều kiện lên men, chiết tách và tinh chế để thu được kháng sinh tinh khiết.  Sơ bộ nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh thu được. [...]...2 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Theo Waksmann, kháng sinh được định nghĩa kinh điển: Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tạo ra, có tác dụng ức chế phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác”.[3] 1.1.2 Phân loại kháng sinh Kháng sinh được phân loại dựa vào cấu trúc hóa... bảo quản giống vi sinh vật 1.4.1 Cải tạo giống vi sinh vật  Mục đích Do các VSV sinh tổng hợp kháng sinh phân lập được từ cơ chất thường có hoạt tính thấp, vì vậy để thu được các chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất đòi hỏi phải cải tạo, chọn giống bằng các phương pháp khác nhau và nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp nhằm các mục đích: - Tăng cường hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Cải tạo... Floroquinolon 1,2,3,4 Oxazolidinon 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh [3] Các kháng sinh có một đích tác dụng khác nhau và hiện tại có 5 đích tác dụng trên VSV như sau: Bảng 1.2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh Cơ chế tác dụng KS Ví dụ Tổng hợp thành tế bào β –lactam, glycopeptid Màng tế bào chất Polypeptid (colistin) Tổng hợp protein Nitrofuran, maclorid Tổng hợp acid nuclenic Phenicol,tetracyclin Ức chế chuyển... đến -200C) [4], [10], [2] 1.5 Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 1.5.1 Khái niệm lên men Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của VSV nhờ xúc tác của các enzym với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho chúng Kháng sinh là sản phẩm trao đổi bậc hai, được tạo thành lúc gần kết thúc quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn, gần hoặc vào chính pha cân... hóa học để nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn gốc 2.2.3 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh - Từ 3 MT lên men bề mặt tốt nhất, chọn 1 MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của kháng sinh trong dịch lọc - Tìm... chọn và giữ lại 3 chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo 18 2.3.5.2 Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV * Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau sàng lọc ngẫu nhiên nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh * Tiến hành: - Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất của sàng lọc ngẫu nhiên cho vào 10ml... chọn 3–5 biến chủng có % biến đổi hoạt tính cao nhất để nghiên cứu tiếp 2.3.6 Phương pháp lên men chìm tổng hợp kháng sinh * Mục đích: Chọn ra chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh nhiều nhất để định hướng cho phát triển sản xuất công nghiệp * Tiến hành: - Tạo giống cấp 1: chủng giống Streptomyces 184. 223 sau khi nuôi cấy trên MT2 thạch nghiêng đủ 6 ngày được cấy vô trùng sang bình nón 500ml... phương pháp giếng thạch - Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men bằng phương pháp giếng thạch 2.3.7 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men - Xác định độ bền nhiệt: lấy khoảng... HTKS của chủng tăng lên trên S.aureus(110,9%) và P.mirabilis(112,2%) Trong đó, biến chủng ĐB 2.4, ĐB 2.5, ĐB 2.6 có HTKS cao nhất Các biến chủng này được giữ lại tiến hành nghiên cứu tiếp theo 3.5 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc  Tiến hành: + Thử độ bền nhiệt của dịch kháng sinh được tiến hành theo mục 2.3.7 26 + Thử độ bền pH của dịch kháng sinh. .. Taitec Bio – Shaker BR 300 LF 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 184. 223 - Xác định một số đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 184. 223 2.2.2 Chọn lọc và cải tạo giống - Lựa chọn MT nuôi cấy tốt nhất cho Streptomyces 184. 223 - Chọn 2 chủng vi khuẩn (1 vi khuẩn G (+) và 1 vi khuẩn G (-)) để làm VSV kiểm định cho các nghiên cứu về sau - Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, . vi khuẩn kháng thuốc. Chi Streptomyces là một chi xạ khuẩn lớn, gồm nhiều xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. Do vậy, tôi chọn đề tài Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces. mặt bào tử (b) của Streptomyces 184. 223 Hình P.7 Phổ tử ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184. 223. Hình P.8 Phổ hồng ngoại vết kháng sinh 2 của Streptomyces 184. 223 Hình P.9 Phổ. Streptomyces 184. 223 ” với các mục tiêu sau:  Tạo biến chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao từ chủng giống Streptomyces 184. 223  Bước đầu nghiên cứu hình thái Streptomyces 184. 223 theo