BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ XUÂN TÌNH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ XUÂN TÌNH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1. ThS. Lê Thị Phương Thảo 2. ThS. Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện : Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia HÀ NỘI 2015 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS. Lê Thị Phương Thảo, ThS. Đặng Thị Ngọc Lan đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân viên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để thực hiện đề tài. Tôi gửi lời cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền thụ kiến thức cho tôi trong năm năm học vừa qua. Cảm ơn bạn bè thân thiết luôn sát cánh, nhiệt tình chia sẻ giúp đỡ tôi suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho bố mẹ, anh chị những người đã chăm sóc, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Xuân Tình MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về độc tố vi nấm aflatoxin 2 1.1.1. Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin 2 1.1.2. Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin 3 1.1.3. Độc tính aflatoxin 4 1.1.4. Một số phương pháp xác định aflatoxin. 6 1.2. Thực trạng sản xuất, sử dụng lạc và quy định giới hạn nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam 9 1.2.1. Thực trạng sản xuất và sử dụng lạc tại Việt Nam 9 1.2.2. Thực trạng nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam 10 1.2.3. Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong lạc 11 1.3. Một số nghiên cứu bảo quản lạc nhằm giảm nhiễm aflatoxin 11 1.3.1. Thế giới 11 1.3.2. Việt Nam 13 1.4. Công nghệ bảo quản 13 1.4.1. Bảo quản bằng bao bì 13 1.4.2. Bảo quản bằng điều biến khí quyển 15 Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ 16 2.1.2. Hóa chất, thuốc thử 17 2.2. Đối tượng và nội dung nghiên cứu 17 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 17 2.2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1. Phương pháp bảo quản 20 2.3.2. Phương pháp kiểm nghiệm 20 Chương III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………………………………… 24 3.1. Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản………………………………………………………… ……24 3.1.1. Xác định độ ẩm của lạc nhân trước khi bảo quản 24 3.1.2. Mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin 25 3.2. Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp 25 3.2.1. Sự thay đổi độ ẩm 25 3.2.2. Xác định hàm lượng AF 30 3.3. Bàn luận 33 3.3.1. Về việc lựa chọn lạc nhân trước khi bảo quản 33 3.3.2. Về chất liệu bảo quản lạc nhân 34 3.3.3. Về thay đổi điều kiện môi trường bảo quản lạc nhân 34 3.3.4. So sánh phương pháp bảo quản truyền thống với phương pháp mới 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Việt Tiếng Anh AF Aflatoxin A. favus Aspergillus flavus AFB1 Aflatoxin B 1 AFB2 Aflatoxin B 2 AFG1 Aflatoxin G 1 AFG2 Aflatoxin G 2 AFM1 Aflatoxin M 1 AFM2 Aflatoxin M 2 A. parasticus Aspergillus parasticus BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn BYT Bộ Y Tế DON Deoxynivalenol ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FAO Tổ chức Nông lương thế giới Food and Agriculture Organization of the United Nations FBs Fumonisins HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid chromatography IARC Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế The International Agency for Research on Cancer ICRISAT Viện Nghiên cứu cây trồng vùng bán khô hạn nhiệt đới quốc tế The International Crops Research Institute for the Semi-Arid- Tropics KPH Không phát hiện KQĐ Không quy định LC Sắc ký lỏng Liquid chromatography ML Giới hạn tối đa Maximum limit MS Khối phổ Mass spectrometry NIV Nivalenol OTA Ochratoxin A PAT Patulin QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam TLC Sắc ký lớp mỏng Thin layer chromatography UHPLC- MS/MS Sắc ký siêu hiệu năng hai lần khối phổ USDA Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ United States Department of Agriculture UV Detector tử ngoại Ultra violet ZEA Zeralenone DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 1.1. Một số tính chất vật lý của aflatoxin 4 Bảng 1.2. Sản lượng lạc của Việt Nam 10 Bảng 1.3. Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong hạt lạc (sau khi đã tách vỏ) 11 Bảng 2.1. Đóng gói lạc với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển thay đổi 19 Bảng 2.2. Mã hóa mẫu lạc nhân trong các điều kiện bảo quản 19 Bảng 2.3. Phương pháp kiểm nghiệm lạc nhân 20 Bảng 2.4. Chương trình gradient phân tích aflatoxin 22 Bảng 2.5. Điều kiện khối phổ thiết bị MS ABI 5500 QQQ 23 Bảng 3.1. Độ ẩm của mẫu lạc nhân trước khi bảo quản 24 Bảng 3.2. Độ ẩm của lạc nhân sau 1 tháng bảo quản 25 Bảng 3.3. Độ ẩm của lạc nhân sau 2 tháng bảo quản 26 Bảng 3.4. Độ ẩm của lạc nhân sau 3 tháng bảo quản 26 Bảng 3.5. Độ ẩm của lạc nhân sau 4 tháng bảo quản 27 Bảng 3.6. Độ ẩm của lạc nhân trong suốt quá trình bảo quản 27 Bảng 3.7. Sự biến thiên độ ẩm của lạc nhân ở điều kiện bảo quản khác nhau giữa các tháng 27 Bảng 3.8. Kết quả aflatoxin trong các mẫu lạc nhân 30 Bảng 3.9. So sánh phương pháp bảo quản lạc nhân 35 Bảng 4.1. Hàm lượng AF trong lạc nhân bảo quản bằng các giải pháp 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang Hình 1.1. So sánh điều kiện cho sự phát triển và sản xuất aflatoxin bởi A. flavus và A. parasiticus. Tối ưu cho tăng trưởng (—) và cho sản xuất aflatoxin ( ) 2 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số aflatoxin 3 Hình 1.3. Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS 8 Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS 9 Hình 1.5. Sơ đồ chiến lược quản lý aflatoxin trong lạc trước và sau thu hoạch 12 Hình 3.1. Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân đã được lựa chọn và lạc nhân chưa được chọn lựa cùng bảo quản trong bao đay điều kiện môi trường không khí thường 28 Hình 3.2. Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân trong các điều kiện bảo quản khác nhau tại các thời điểm khác nhau 29 Hình 3.3. Hàm lượng AF trong các mẫu lạc nhân 32 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có nguồn gốc từ Nam Mỹ được trồng rộng rãi trên khắp đất nước Việt Nam cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao. Hạt lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người do có chứa 27,5% protein, 44,5% lipit, 15,5% glucid, các nguyên tố vi lượng (kali, phospho, magie, mangan, sắt, natri, kẽm, đồng), các vitamin (PP, E, B 5 , B 1 , B 2 , B 6 , folat), các axit amin [11]. Do có giá trị dinh dưỡng cao, từ lâu loài người đã sử dụng lạc như một nguồn thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp dầu, magarin, kẹo bánh, nước chấm Việt Nam có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, trong đó có nhiều loài sinh độc tố vi nấm. Trong khi lạc là cơ chất thích hợp đối với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin (AF), chất được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế (IARC) phân loại thuộc nhóm có độc tính cao gây ung thư [23]. Do đó, việc nghiên cứu các giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm aflatoxin trong lạc và sản phẩm từ lạc là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. Trên thế giới đã có các nghiên cứu về giải pháp nhằm hạn chế sự phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin và biện pháp làm giảm hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm. Đối với lạc sau thu hoạch, một số nghiên cứu có dùng hóa chất, hoạt chất từ thực vật hoặc vi sinh vật, tuy nhiên, các biện pháp này còn hạn chế do ảnh hưởng đến cảm quan và an toàn thực phẩm của lạc. Lạc trong quá trình bảo quản vẫn tiếp tục hô hấp, sinh hơi nước tạo môi trường ẩm thuận lợi cho nấm mốc phát triển, trong đó có nấm sinh độc tố aflatoxin. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin” với mục tiêu của đề tài là: 1. Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản. 2. Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các biện pháp bảo quản khác nhau. [...]... trên, tiến hành xác định hàm lượng độc tố vi nấm aflatoxin trong 10 mẫu lạc nhân trước khi bảo quản Kết quả phân tích cho thấy không phát hiện mẫu nào nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin Mẫu lạc nhân trước khi được bảo quản chưa phát hiện có độc tố vi nấm aflatoxin 3.2 Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp 3.2.1 Sự thay đổi độ ẩm ... mẫu lạc được chọn lựa, đóng gói và bảo quản bằng bao đay kiểm tra sau bảo quản 1 tháng 20 - PP1 là mẫu lạc được bảo quản bằng túi PP ở điều kiện không khí thường sau 1 tháng bảo quản - PCK1 là mẫu lạc được bảo quản bằng túi PP hút chân không sau 1 tháng bảo quản - PN1 là mẫu lạc được bảo quản bằng túi PP trong môi trường khí nitơ sau 1 tháng bảo quản 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp bảo quản. .. Tổng quan về độc tố vi nấm aflatoxin Theo số liệu thống kê của tổ chức Nông lương thế giới (FAO), ước tính có khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm độc tố vi nấm mycotoxin sản sinh chủ yếu bởi chi nấm Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium và Claviceps [21] Trong số các độc tố vi nấm, aflatoxin được xem như độc tố chính được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện... độ nhiễm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản - Lạc nhân thu mua tại Bắc Giang được chọn chất lượng đồng đều 18 - Mẫu lạc ban đầu qua chọn lựa được đem đi kiểm tra độ ẩm và hàm lượng aflatoxin trong lạc với số lượng 10 mẫu lạc nhân lấy ngẫu nhiên từ lô lạc thu về - Kiểm tra độ ẩm và tình trạng nhiễm aflatoxin - Mẫu lạc kiểm tra có nhiễm aflatoxin sẽ được loại khỏi thí nghiệm  Định kỳ đánh giá. .. độ Aflatoxin trongdịch chiết mẫu tính theo chuẩn (ng/mL) m: Khối lượng của mẫu phân tích (g) X: hàm lượng Aflatoxin trong mẫu phân tích (ng/g) K: Hệ số pha loãng (nếu có) 24 Chương III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản 3.1.1 Xác định độ ẩm của lạc nhân trước khi bảo quản Kết quả xác định độ ẩm của 10 mẫu lạc nhân trước khi bảo. .. thường không làm được Với những ưu điểm của phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ chúng tôi đã chọn để phân tích độc tố aflatoxin trong lạc nhân để đánh giá một số biện pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm AF  Kỹ thuật sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ Mô hình đơn giản của hệ thống LC-MS như ở hình 1.3 Sắc ký lỏng Ion hóa Bộ phân tích khối Detector/ Lưu giữ số liệu Hình 1.3: Mô hình đơn giản hệ thống... lạc có độ ẩm 14 - 16%; Lạc bảo quản mát sau 6 tháng có hàm lượng AF thấp hơn lạc bảo quản thường, lạc bảo quản bao hai lớp có hàm lượng AF nhiễm cao hơn lạc bảo quản bằng bồ cót và bao dứa ở cùng điều kiện 1.4 Công nghệ bảo quản 1.4.1 Bảo quản bằng bao bì Bao bì chứa đựng thực phẩm không chỉ có chức năng vận chuyển, chứa đựng mà còn là phương tiện quan trọng để giữ gìn nguyên vẹn số lượng và chất lượng... hưởng của điều kiện bảo quản đến chất lượng và sự ô nhiễm aflatoxin trong lạc ở Kenya cho thấy lạc bảo quản sau 6 tháng trong bao đay bị nhiễm aflatoxin thấp hơn lạc bảo quản trong bao polyethylen và polypropylene [11] Trong nghiên cứu này, đề tài dùng bao đay bảo quản như mẫu 15 chứng, còn loại bao bì túi PP được sử dụng để thay đổi môi trường khí quyển trong bao gói 1.4.2 Bảo quản bằng điều biến... kiểm tra độ ẩm của 10 mẫu lạc nhân ban đầu cho thấy độ ẩm trung bình của lạc nhân đạt 6,45%, mẫu có độ ẩm lớn nhất là 6,88% trong khi mẫu có độ ẩm nhỏ nhất đạt 5,77% đều thấp hơn giới hạn cho phép (≤10%) Mẫu lạc nhân trước 25 khi được bảo quản đạt chỉ tiêu độ ẩm nằm trong giới hạn cho phép theo QCVN 01 – 48: 2011/BNNPTNT 3.1.2 Mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin Bằng phương pháp LC-MS/MS nên trên, tiến... nhất về mọi phương diện 1.1.1 Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin 1.1.1.1 Chủng nấm sinh độc tố Aflatoxin được sinh ra chủ yếu bởi hai chủng nấm thuộc loài Aspergillus phân nhóm Flavi: Aspergillus flavus và Aspergillus parasticus Trong đó, Aspergillus flavus là loài nấm gây nhiễm độc phổ biến hơn trong nông nghiệp Aspergillus parasiticus sống thích nghi trong môi trường đất . cho nấm mốc phát triển, trong đó có nấm sinh độc tố aflatoxin. Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin . độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản. 2. Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các biện pháp bảo quản. LÊ XUÂN TÌNH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1. ThS. Lê Thị Phương Thảo 2. ThS.