BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN THUẬN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN THUẬN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2014   LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người cống hiến nghiệp giáo dục, người tận tình bảo hướng dẫn em suốt q trình nghiên cứu, hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thanh Phương – Giám Đốc Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội người tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thành Đạt – Phó Giám Đốc Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội hết lịng hướng dẫn em thực khóa luận Cuối cùng, em xin cảm ơn toàn thể cán nhân viên Trung Tâm Kiểm Nghiệm Hà Nội, gia đình bạn bè, người ln động viên, khích lệ tạo động lực cho em suốt trình học tập thực luận văn Hà nội, ngày 03 tháng 09 năm 2014 Học Viên Nguyễn Văn Thuận LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1 Công thức cấu tạo, phân loại phổ tác dụng 1.1.2 Công thức phân tử, công thức cấu tạo, đặc tính cephalosporin nghiên cứu .4 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2.1 Các phương pháp chiết tách 1.2.2 Tổng quan phương pháp săc ký lỏng- khối phổ .11 1.2.2.1 1.2.2.2 Một số kỹ thuật ghi phổ .14 1.2.2.3 1.3 Thiết bị khối phổ .11 Một số ưu điểm sắc ký lỏng- khối phổ 15 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ DƯ LƯỢNG THUỐC KHÁNG SINH CÓ TRONG NƯỚC Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ GIỚI 15 1.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CÁC CEPHALOSPORIN TRÊN THẾ GIỚI 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 20 2.1.1 Hóa chất – chất chuẩn 20 2.1.2 Máy móc- thiết bị 20 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phương pháp thu thập xử lý mẫu 21 2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 21 2.2.3 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng số Cephalosporin kỹ thuật LC/MS/MS 22 2.2.4 Đánh giá phương pháp phân tích 22 2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 26 3.1.1 Khảo sát điều kiện đo phổ khối 26 3.1.2 Khảo sát điều kiện LC 28 3.1.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 36 3.1.4 Quy trình phân tích 39 3.2 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 41 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 41 3.2.2 Tính chọn lọc phương pháp 41 3.2.3 Độ tuyến tính 46 3.2.4 Độ xác phương pháp 46 3.2.5 Giới hạn phát giới hạn định lượng 49 3.3 ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG KHÁNG SINH CĨ TRONG NƯỚC THẢI CƠNG NGHIỆP DƯỢC 51 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 54 4.1 LỰA CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 54 4.2 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 54 4.3 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 56 4.3.1 Tình hình kháng kháng sinh 56 4.3.2 Nghiên cứu dư lượng kháng sinh môi trường Việt Nam 58 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ 61 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BP 2010 Dược điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia) IS Internal standard (chuẩn nội) C18 Octadecyl carbon chain DAD Detector chuỗi diod (Diode array detector) HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High perform liquid chromatography) LC- Sắc kí lỏng khối phổ lần (High perform liquid chromatography – Tandem MS/MS Mass Spectrometry) tR Thời gian lưu Spíc Diện tích pic SIS Diện tích pic chuẩn nội TB Trung bình MeOH Methanol mg Milligram ml Mililit PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis) UV - VIS Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible absorption Spectrophotometry) LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) SPE Chiết pha rắn (solid phase extraction) IAC Chiết lực miễn dịch DANH MỤC CÁC BẢNG  Bảng 1.1 Phổ tác dụng cephalosporin Bảng 1.2.Công thức, đặc tính cephalosporin nghiên cứu .5 Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu cần có 20 Bảng 3.1 Điều kiện nguồn ion hóa ESI 26 Bảng 3.2: Kết lựa chọn ion mẹ 27 Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá ion kháng sinh, IS 28 Bảng 3.4 Chương trình Gradient pha động 29 Bảng 3.5 Kết khảo sát cột sắc ký 31 Bảng 3.6 Khảo sát qui trình chiết pha rắn 37 Bảng 3.7 Kết khảo sát qui trình chiết pha rắn 38 Bảng 3.8 Điều kiện LC MS 40 Bảng 3.9 Độ thích hợp hệ thống thời gian tỷ số diện tích kháng sinh so với chuẩn nội 42 Bảng 3.10: Sự phụ thuộc tuyến tính tỷ lệ diện tích kháng sinh chuẩn nội theo nồng độ 47 Bảng 3.11 Đánh giá độ xác độ phương pháp 48 Bảng 3.12: Giá trị LOD LOQ phương pháp 49 Bảng 3.13 Kết phân tích mẫu nước thải thứ 51 Bảng 3.13 Kết phân tích mẫu nước thải thứ hai 52 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức chung cephalosporin Hình 1.2: Cấu tạo thiết bị khối phổ 12 Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát chương trình pha dộng 29 Hình 3.2 Kết khảo sát cột sắc ký 32 Hình 3.3: Kết khảo sát thể tích tiêm mẫu 34 Hình 3.4: Kết khảo sát tốc độ dòng pha động 36 Hình 3.5: Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết qui trình chiết pha rắn 38 Hình 3.6 Sắc ký đồ xác định tính đặc hiệu 45 Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu LOD 50 Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu thử thứ 52 Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử thứ hai 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Việc sử dụng kháng sinh cách ạt, thiếu kiểm soát trở thành vấn đề thời ngành y tế, việc gia tăng tình trạng kháng kháng sinh hậu nghiêm trọng Bên cạnh nguyên nhân việc sử dụng thuốc khơng hợp lý lý khác quan tâm tồn dư lượng kháng sinh chất chuyển hoá chúng mơi trường cần dư lượng nhỏ kháng sinh thải môi trường tích lũy vào vi khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển gen kháng thuốc Hướng nghiên cứu dư lượng thuốc kháng sinh chất chuyển hoá tác động chúng môi trường năm cuối thập kỉ 90 kỷ 20 quan tâm nước phát triển Nhiều nghiên cứu cho thấy tồn kháng sinh đề kháng kháng sinh môi trường nước trở nên phổ biến [17], [36] Song song với việc nâng cao chất lượng chăm sóc khám chữa bệnh cho nhân dân, lĩnh vực sản xuất thuốc đặc biệt trọng Hiện nước có khoảng gần 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc với đủ chủng loại: kháng sinh, thuốc chống viêm, thuốc tim mạch, thuốc bổ vitamin…Kháng sinh nhóm Cephalosporin có phổ kháng khuẩn rộng trực khuẩn Gram (-) Gram (+), định rộng rãi việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn nước ta Hiện có nhiều nhà máy, xí nghiệp dược sản xuất nhóm kháng sinh với dạng bào chế khác như: viên nén, viên nang, bột pha hỗn dịch uống…Tuy nhiên, việc kiểm soát tồn dư kháng sinh nhóm Cephalosporin nước thải sở sản xuất chưa quan tâm mức Tới thời điểm nay, Việt Nam có số nghiên cứu xác định dư lượng số kháng sinh nước thải bệnh viện [2], nước sông [34],nhưng đối tượng nước thải từ sở sản xuất dược bước đầu nghiên cứu có nghiên cứu dư lượng cefixim công bố [20] Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định dư lượng số cephalosporin nước thải nhà máy dược phẩm phương pháp LC/MS-MS” với mục tiêu sau: Khảo sát lựa chọn điều kiện phân tích qui trình xử lý mẫu để xác định đồng thời dư lượng kháng sinh Cephalexin, Cefuroxim, Cefixim nước thải từ sở sản xuất Dược kỹ thuật LC/MS-MS nồng độ ppb Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh nước thải nhà máy sản xuất dược phẩm   PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ KHẢO SÁT ĐỘ ĐÚNG ĐỘ CHÍNH XÁC CỦA PHƯƠNG PHÁP   PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ MẪU THỬ CƠ SỞ SẢN XUẤT DƯỢC M2 PHỤ LỤC PHỔ ĐỒ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU ... VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN VĂN THUẬN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG MỘT SỐ CEPHALOSPORIN TRONG NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/ MS- MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC... tượng nước thải từ sở sản xuất dư? ??c bước đầu nghiên cứu có nghiên cứu dư lượng cefixim công bố [20] Xuất phát từ lý trên, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu xác định dư lượng số cephalosporin nước thải. .. nước thải từ sở sản xuất Dư? ??c kỹ thuật LC/ MS- MS nồng độ ppb Thẩm định phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh bước đầu ứng dụng phương pháp để đánh giá dư lượng kháng sinh nước thải nhà máy