BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ LƯƠNG NHẬT VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α- GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ĐINH LĂNG POLYSCIAS FRUTICOSA (L.)HARMS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ LƯƠNG NHẬT VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α- GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ĐINH LĂNG POLYSCIAS FRUTICOSA (L.)HARMS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60 72 04 06 Người hướng dẫn: TS. ĐÀO THỊ THANH HIỀN TS. NGUYỄN TIẾN ĐẠT HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực, các anh chị kĩ thuật viên, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng sau đại học, các thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Dược học cổ truyền - Trường ĐH Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuậ n lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS. Đào Thị Thanh Hiền, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Tiến Đạt, cùng các cán bộ ở Phòng Hoạt chất sinh học –Viện hóa sinh biển - Viện hàn lâm khoa h ọc và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè - những người đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập cũng như trong cuộc số ng Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày 26 tháng 8 năm 2014 Hồ Lương Nhật Vinh MỤC LỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về thực vật 3 1.1.1. Tổng quan về chi Polyscias 3 1.1.1.1. Vị trí phân loại 3 1.1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Polyscias 3 1.1.2. Tổng quan về loài Polyscias fruticosa (L.) Harms 4 1.1.2.1. Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật 4 1.1.2.2. Thành phần hóa học 6 1.1.2.3. Tác dụng sinh học 11 1.1.2.4. Một số bài thuốc y học cổ truyền 12 1.2. Tổng quan về enzym α - amylase và enzym α - glucosidase 13 1.2.1. Khái niệm enzym 13 1.2.2. Chất ức chế enzyme 13 1.2.3. Enzyme amylase 15 1.2.3.1. Đặc tính của enzyme α - amylase 15 1.2.3.2. Đặc tính của enzym α - glucosidase 16 1.2.4. Chất ức chế α - amylase và α - glucosidase 17 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng nghiên cứu 20 2.2. Phương tiện nghiên cứu 20 2.2.1. Hóa chất, thuốc thử 20 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu 20 2.2.3. Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 20 2.2.4. Dụng cụ thiết bị thử hoạt tính in vitro 21 2.2.5. Dụng cụ và thiết bị thử loại hoạt tính in vivo 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1. Nghiên cứu thành phần hóa học 21 2.3.1.1. Định tính một số nhóm chất hữu cơ chính 21 2.3.1.2. Chiết xuất và phân lập 21 2.3.1.3. Xác định cấu trúc 24 2.3.2. Nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym α - amylase và α - glucosidase in vitro 24 2.3.3. Nghiên cứu về tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo 26 2.3.3.1. Mô hình chuột uống đường sucarose liều cao 27 2.3.3.2. Mô hình chuột gây tiểu đường bằng Streptozocin 27 Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29 3.1. Xác định tên khoa học của cây Đinh lăng nghiên cứu 29 3.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học 29 3.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong lá Đinh lăng 29 3.2.2. Định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn chiết lá Đinh lăng 30 3.2.3. Phân lập các chất trong phân đoạn nghiên cứu 30 3.3. Nhận dạng cấu trúc các chất phân lập được 32 3.3.1. Nhận dạng chất PFW1 32 3.3.2. Nhận dạng PFW8 35 3.3.3. Nhận dạng PFW2 37 3.4. Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α - amylase và α - glucosidase invitro 39 3.4.1. Nghiên cứu in vitro tác dụng ức chế enzym α - amylase 38 3.4.2. Nghiên cứu in vitro tác dụng ức chế enzym α - glucosidase 40 3.5. Nghiên cứu tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo 41 3.5.1. Mô hình chuột dung nạp đường sucarose liều cao 41 3.5.2. Mô hình chuột gây tiểu đường bằng Streptozocin 43 Chương 4: BÀN LUẬN 46 4.1. Về phương pháp 46 4.2. Về thành phần hóa học 47 4.3. Về tác dụng sinh học 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 53 1. Kết luận 53 2. Đề xuất 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 13 C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance DC Dịch chiết DEPT Distortionless Enhancemnt by Polarisation Transfer DMSO Dimethyl sulfoxid ĐTĐ Đái tháo đường ESI-MS Electrospray ionisation mass 1 H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance HMBC Heteronuclear mutiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence IC 50 Inhibitory Concentration 50% NXB Nhà xuất bản p Page pNG p-nitrophenyl-α-D-glucospyranoside P.Đ Phân đoạn tr Trang TT Thuốc thử TS Tiến sĩ SKLM Sắc ký lớp mỏng STZ Streptozocin DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tóm tắt các saponin triterpenoid trong cây Đinh lăng 7 Bảng 1.2. Một số acid amin có trong cây Đinh lăng 8 Bảng 1.3. Một số vitamin có trong cây Đinh lăng 9 Bảng 1.4. Một số Polyacetylen có trong cây Đinh lăng 9 Bảng 1.5. Một số tinh dầu có trong cây Đinh lăng 10 Bảng 1.6. Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzyme α - amylase 17 Bảng 1.7. Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzyme α - glucosidase 18 Bảng 3.1. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong lá Đinh lăng 29 Bảng 3.2. Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn F2 31 Bảng 3.3. Số liệu phổ 13 C - NMR của các hợp chất PFW1 32 Bảng 3.4. Số liệu phổ 13 C - NMR của các hợp chất PFW1 và PFW8 36 Bảng 3.5. Số liệu phổ 13 C - NMR của các hợp chất PFW8 và PFW2 38 Bảng 3.6. Kết quả IC 50 hoạt tính ức chế α - amylase 39 Bảng 3.7. Kết quả IC 50 hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase 40 Bảng 3.8. Nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình chống dung nạp sucarose tại các thời điểm nghiên cứu 42 Bảng 3.9. Khối lượng của chuột ở các thời điểm nghiên cứu 43 Bảng 3.10. Nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình gây tăng đường huyết bằng STZ tại các thời điểm nghiên cứu 44 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái thực vật cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) 5 Hình 1.2. Công thức saponin triterpenoid của cây Đinh lăng 6 Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể 17 Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn nghiên cứu 22 Hình2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất PFW1, PFW2, PFW8 24 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của chất PFW1 35 Hình 3.4. Tương tác HMBC của hợp chất PFW1 35 Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của chất PFW8 37 Hình 3.6. Cấu trúc hóa học của chất PFW2 39 Hình 3.7. Biểu đồ so sánh hoạt tính ức chế α - amylase của cao chiết và chất PFW1 40 Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hoạt tính ức chế α - glucosidase của cao chiết và chất PFW1 41 Hình 3.9. Biểu đồ so sánh nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình chống dung nạp sucarose liều cao tại các thời điểm nghiên cứu 42 Hình 3.10. Biểu đồ so sánh nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình gây tăng đường huyết bằng STZ tại các thời điểm nghiên cứu 44 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) typ 2 là một bệnh mạn tính do rối loạn chuyển hóa đang có chiều hướng ngày càng phổ biến và gia tăng trên thế giới và ở Việt Nam. Bệnh gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm như tim mạch, đột quỵ, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư [5]… Các thuốc tân dược điều trị ĐTĐ đều có chi phí cao, nhiều tác dụng phụ và số lượng b ệnh nhân sử dụng thuốc kiểm soát được đường huyết còn hạn chế. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm các thuốc mới từ dược liệu có tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ hiệu quả, an toàn, giá rẻ, ít tác dụng phụ và đường huyết của bệnh nhân ổn định hơn đang là vấn đề được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm. Có nhiều nhóm thuốc đượ c sử dụng trong các phác đồ điều trị ĐTĐ typ 2 trong đó nhóm ức chế men α-glucosidase, là nhóm thuốc có tác dụng làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrate làm glucose máu tăng chậm hơn sau ăn, giảm nguy cơ tăng glucose máu và nồng độ glucose máu ban ngày ít dao động. Tuy nhiên, thuốc gây ra một số tác dụng không mong muốn như đầy bụng, phân nát, ỉa chảy, buồn nôn, gây bất thường chức năng gan, ngứa da, ngoại ban…[10]. Cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms thuộ c họ Ngũ gia bì được sử dụng từ lâu trong y học phương Đông với tác dụng bổ dưỡng, kích thích tiêu hóa, giải độc, kháng khuẩn, tiêu viêm, tăng thể lực và tăng sức bền [18]. Bộ phận rễ củ của cây Đinh lăng đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu khá chi tiết cả về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học. Tuy nhiên lại không có nhiều nghiên cứu trên bộ phận lá mặc dù lá Đ inh lăng cũng có thành phần hóa học giống rễ [12], mà đây lại là nguồn dược liệu phong phú, dễ khai thác. Trong chương trình sàng lọc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh tiểu đường từ nguồn dược liệu thiên nhiên, chúng tôi đã phát hiện dịch chiết toàn phần lá Đinh lăng thể hiện hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase, đây là những enzyme đóng vai trò thủy phân carbohydrate có liên quan trực tiếp đến việ c tăng đường huyết. [...]... sau: 1 Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Đinh lăng và một phân đoạn dịch chiết lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) 2 Thử tác dụng ức chế α -amylase và α -glucosidase in vitro của phân đoạn nghiên cứu 3 Thử tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết của chất phân lập được từ phân đoạn nghiên cứu Để đạt được 3 mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau: Nghiên cứu về thành phần hóa. .. trong dịch chiết tổng và một phân đoạn dịch chiết của lá Đinh lăng - Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nghiên cứu - Xác định cấu trúc các chất phân lập được Nghiên cứu về tác dụng sinh học: - Khảo sát tác dụng ức chế α -amylase và α -glucosidase in vitro của phân đoạn nghiên cứu và một chất phân lập được - Khảo sát tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo của chất phân. .. Sơ đồ chiết xuất phân đoạn nghiên cứu 22 Phân lập Qua nghiên cứu tài liệu về tác dụng sinh học của cây Đinh lăng và của saponin triterpen, kết hợp với kết quả nghiên cứu dược lý (được trình bày ở phần 3. 4) của dịch chiết (dịch tổng methanol, phân đoạn nước, phân đoạn F 2) thấy phân đoạn F2 có tác dụng ức chế enzyme α -amylase và α -glucosidase rất mạnh Do đó phân đoạn này được tiến hành chiết xuất, phân. ..Với mong muốn nghiên cứu ra các loại thuốc điều trị ĐTĐ mới có nguồn gốc từ dược liệu với tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ hiệu quả, an toàn, giá rẻ và ít tác dụng phụ mà vẫn bảo tồn được nguồn dược liệu quý trong nước, đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng ức chế enzyme α -amylase và α -glucosidase của phân đoạn dịch chiết lá cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) ” được thực hiện với... pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.1.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ chính - Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ chính có trong lá Đinh lăng và trong phân đoạn nghiên cứu: bằng các phản ứng đặc trưng của các nhóm chất [7] 2.3.1.2 Chiết xuất và phân lập * Quy trình chiết xuất phân đoạn lá Đinh lăng Lá Đinh lăng được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm và xay nhỏ thành bột (4 kg)... ( -)3 -O-galloylepicatechin, ( -)- 3-O-galloylcatechin 19 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Mẫu cây tươi cả rễ, thân, lá Đinh lăng có độ tuổi trên 1 năm được thu hái ở Đại Từ- TP Thái Nguyên để phân tích hình thái và giám định tên khoa học - Lá cây Đinh lăng để nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng sinh học 2.2 Phương tiện nghiên cứu 2.2.1 Hóa chất, thuốc thử + Dung môi chiết và chạy... kết hợp với enzyme tự do Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzyme làm giảm hoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzyme-chất nền Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế - Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition): chất ức chế kết hợp với enzyme ở vị trí khác với vị trí kết hợp của chất nền tạo thành phức enzyme-chất... (1 2) ▪ Acid 3-O-[α-rhamnopiranosyl-(1- 4)- β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-Dglucopyranosyl] oleanolic (1 3) Hình 1.2 Công thức saponin triterpenoid của cây Đinh lăng 6 Bảng 1.1 Tóm tắt các saponin triterpen trong cây Đinh lăng (Công thức chung ở hình 1. 2) R2 R1 ( 1) Glc-(1 4)- Glc- H ( 2) Glc-(1 2)- Glc- H ( 3) Glc-(1 2) Glc- H Glc-(1 4) ( 4) Ara-(1 2) Glc- H Glc-(1 4) ( 5) Gal-(1 2) Glc- H Glc-(1 3) ( 6) Glc-(1 4)- Glc-... tuyến tụy Có 6 loại enzyme được chia vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào) + Endoamylase gồm: α -amylase, pullulanase (hay α-dextrin 6 -glucosidase) , transglucosilase (hay oligo-1,6 -glucosidase) , amylo-1,6 -glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaacharide + Exoamylase gồm: β -amylase và γ -amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ... 100: 0) thu được 3 phân đoạn ký hiệu F1-F3 Phân đoạn F2 được sử dụng để nghiên cứu Quy trình chiết xuất phân đoạn nghiên cứu được trình bày ở hình 3.1 Bột dược liệu (4 kg) MeOH/nhiệt độ phòng (10 l x 3 lần) Dịch chiết MeOH Cô quay t , áp suất giảm 0 Cắn MeOH (470 g) Phân tán trong nước Chiết phân đoạn + cloroform (1l x 3 lần) Cắn cloroform Dịch nước Diaion HP-20, methanol:nước ( 0:100, 25:75, 100: 0) F1 . lá cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L. ) Harms) ” được thực hiện với các mục tiêu chính sau: 1. Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Đinh lăng và một phân đoạn dịch chiết lá Đinh lăng (Polyscias. NHẬT VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α- GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ĐINH LĂNG POLYSCIAS FRUTICOSA (L. )HARMS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC. Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α - amylase và α - glucosidase invitro 39 3.4.1. Nghiên cứu in vitro tác dụng ức chế enzym α - amylase 38 3.4.2. Nghiên cứu in vitro tác dụng ức chế enzym