BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ I HC HÀ NI PHM TH ANH NGHIÊN CU THÀNH PHN HÓA HC, TÁC DNG CHNG OXY HÓA VÀ BO V GAN CA HT VI (SEMEN LITCHI CHINENSIS) LUC HC HÀ NI  2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ I HC HÀ NI PHM TH ANH NGHIÊN CU THÀNH PHN HÓA HC, TÁC DNG CHNG OXY HÓA VÀ BO V GAN CA HT VI (SEMEN LITCHI CHINENSIS) LUC HC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60 72 04 06 Nng dn khoa hc: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển HÀ NI 2013 LI C Vi tt c tm lòng, em xin gi li cc nhn Thầy PGS.TS. Nguyễn Mạnh Tuyển. Th ã tn tình ng dn, ch bo và truyt nhng nhng kinh nghim quý báu cã ng viên, h tr em v mi mt trong quá trình hc tp và nghiên cu. Em xin bày t lònng m và li cn TS. Phƣơng Thiện Thƣơngi , h tr cho em rt nhiu  t cho em nhng kinh nghim, ng viên em nhng lúc khó t trong sut thi gian thc hi tài. Xin chân thành cquí Thầy Cô và các anh chị em kỹ thuật viên bộ môn Dƣợc học cổ truyền, trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội o mi u kin cho em thc hin lu     i các anh chị em khoa Hóa phân tích và khoa Dƣợc lý- Viện Dƣợc liệu, các bạn trong tập thể chuyên ngành Dƣợc học cổ truyền lớp CH16   tôi rt nhiu trong thi gian qua. Xin cgia đình ã tu kin cho tôi hc tng lc ln t qua m Mt ln na xin gi li cc n quý thy cô, các bng viên và   tôi có th hoàn thành lun  này. Hà n Học viên Phạm Thị Anh MC LC T V 1 NG QUAN 3 1.1. V trí phân lom thc vt, phân b ca chi Litchi Sonn. 3 1.1.1. Vị trí phân loại chi Litchi Sonn. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Litchi Sonn. 3 1.2. Cây Vi (Litchi chinensis Sonn.). 4 1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố của cây Vải Litchi chinensis Sonn. 4 1.2.2. Thành phần hóa học của cây Litchi chinensis Sonn. 5 1.2.3. Tác dụng sinh học 11 : NGUYÊN LIU, TRANG THIT B VÀ  NGHIÊN CU 16 2.1. Nguyên liu 16 n 17 2.2.1. Động vật thí nghiệm 17 2.2.2. Thiết bị 17 2.2.3. Hóa chất 18 u 18 2.3.1. Xác định mẫu nghiên cứu 18 2.3.2. Phương pháp chiết xuất 19 2.3.3. Nghiên cứu thành phần hóa học 20 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 21 2.3.5. Phương pháp phân lập các chất 26 T QU NGHIÊN CU 28 3.1. m mu nghiên cu 28 3.2. Kt qu nghiên cu thành phn hóa hc 29 3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu hạt vải bằng phản ứng hóa học. 29 3.2.2. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải 37 3.4. Kt qu kho sát tác dng chng oxy hóa và bo v gan 45 3.4.1.Chiết xuất để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa 45 3.4.2.Thử nghiệm dọn gốc DPPH. ……………………………………………… 47 3.4.3. Kết quả khảo sát tác dụng bảo vệ gan 48 3.5. Phân lp các cht 52 3.5.1. Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột 52 3.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định sự có mặt của chất phân lập trong dược liệu 55 3.5.3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được 58 N 65 nh mu nghiên cu 65 4.2. V thành phn hóa hc 65 4.3. V tác dng sinh hc 66 4.4. Các cht phân lc 70 KT LUN VÀ KIN NGH 73 DANH MC CÁC KÝ HIU, CÁC CH VIT TT Chữ tắt Ch nguyên  AST Aspartat aminotransferase Enzym Aspartat aminotransferase ALT Alanin aminotransferase Enzym Alanin aminotransferase CCl4 Carbon tetrachloride Carbon tetrachlorid CHCl 3 Cloroform Dung môi cloroform C-NMR Carbon nuclear magnetic resonance Phổ cacbon d Doublet Đỉnh đôi dd Doublet of doublet Đỉnh đôi kép DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxid DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl- hydrazyl Thuốc thử 1,1- diphenyl-2- picrylhydrazyl H-NMR Proton nuclear magnetic resonance Phổ cộng hƣởng proton IC Inhibitory concentration Nồng độ ức chế IR Infrared spetroscopy Phổ hồng ngoại M Multiplet Đỉnh đa MDA Malonyldialdehyde Malonyldialdehyd MeOH Methanol Dung môi metanol MS Mass spetrometry Khối phổ NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân ppm Part per million Phần triệu s Singlet (kỹ thuật phổ NMR) TBA Thiobarbituric acid Acid thiobarbituric UV Ultraviolet Tử ngoại δC Carbon chemicalshift Chuyển dịch hóa học của cacbon δH Proton chemicalshift Chuyển dịch hóa học của hydro DANH MC CÁC BNG STT Tên  Trang 1 Bng 1.1: Tóm tt thành phn hóa hc ca qu Vi 8 2 Bảng 1.2: Thành phần dinh dƣỡng trong củi Vải (giá trị tƣơng đƣơng trong 100g) 11 3 Bng 2.3. Hn hp phn ng 23 4 Bng 2.4. N mu thí nghim 23 5 Bng 3.5. Kt qu nh tính ht Vi bng phn ng hóa hc 36 6 Bng 3.6. Kt qu  m ht Vi 38 7 Bng 3.7. Kt qu n 39 8 Bng 3.8. Kt qu nh tính cn bng phn ng hóa hc 39 9 Bng 3.9. Kt qu sàng lc hot tính dn gc t do DPPH 47 10 B giá tác dng bo v gan trên enzym AST và ALT 49 11 Bng 3.11. ng ca cao HVT1 lên n bilirubin. 50 12 Bng 3.12. Tác dng chng oxy hóa in vivo 51 13 Bng 3.13. S liu ph cng t nhân và DEPT ca MS1 và acid 3,4 dihydroxy benzoic 59 14 B 63 DANH MC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Litchi chinensis) trên  5 2 Hình 2.2. Hình nh ht Vi 16 3  thi gian làm thc nghim NC tác dng bo v gan 26 4 Hình 3.4. nh chm bt ht Vi kính hin vi 28 5 Hình 3.5.Tinh th hình kim 33 6 Hình 3.6. S cn n-hexan vi h 2 42 7 Hình 3.7. S cn ethyl acetat vi h 1 43 8 Hình 3.8. S cn n- butanol vi h 1 44 9  chin t ht Vi 46 10  th kt qu hot tính dn gc t do DPPH ca các mu cao 47 11  phân lp cht tinh khit 55 12 Hình 3.12. S ca cht MS1 56 13 Hình 3.13. s ca cht MS2 57 14 Hình 3.14. s các cht phân lc liu 57 15 Hình 3.15. Cht MS1 58 16 Hình 3.16. Cht MS2 60 1 T V Bắt đầu vào khoảng năm 1950, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu nguyên nhân gây ra hàng loạt những bệnh nguy hiểm, nổi cộm nhƣ suy tim, đột quỵ, viêm khớp, viêm gan, tiểu đƣờng, rối loạn thần kinh…, trầm trọng nhất là bệnh ung thƣ với mức độ ngày càng gia tăng và phổ biến, mặc dù điều kiện sống ngày càng đƣợc nâng cao. Kẻ thù đáng nghi ngờ đầu tiên chính là các tác nhân hóa học có sức phá hủy mạnh đƣợc gọi là các gốc tự do [29], [30]. Mãi đến những năm 80 của thế kỷ XX, con ngƣời mới chú ý đến vũ khí tiềm năng có khả năng loại bỏ các gốc tự do, đó là các hoạt chất chống oxy hóa trong thực vật. Hiện nay đã tìm ra rất nhiều bệnh liên quan đến gốc tự do [35], [64]. Vì vậy xu hƣớng đi tìm kiếm nguồn tài nguyên có tác dụng chống oxy hóa đang trở nên cần thiết. Vải (Litchi chinensis Sonn., Sapindaceae) là loài cây cận nhiệt đới và nhiệt đới, đƣợc trồng khá phổ biến trên nhiều quốc gia. Tại Việt Nam nói chung và khu vực Miền Bắc nói riêng diện tích các vùng trồng cây Vải rất lớn. Thực tế cho thấy quả Vải giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc gia và nông dân địa phƣơng. Là một phần trong quả Vải thì hạt Vải (chiếm 10- 20% tổng trọng lƣợng quả) đƣợc xem là rác thải và loại bỏ, mặc dù nó đã đƣợc sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ… [22], [68]. Một số công trình nghiên cứu mới đây đã chỉ ra rằng hạt Vải có nhiều tác dụng dƣợc lý nhƣ hạ glucose huyết và hạ lipid máu, chống oxy hóa, chống virus, chống ung thƣ,… [41], [45], [51], [69]. Các tác dụng này có liên quan đến khả năng loại bỏ các gốc tự do của nhiều hợp chất polyphenol, saponin, flavonoid, chất béo… đã đƣợc công bố phân lập từ hạt Vải và nhiều dƣợc liệu khác [29], [32], [52], [69]. Để có thêm cơ sở khoa học cho việc sử dụng hạt Vải trong y học và góp phần tìm kiếm nguồn Dƣợc liệu có tác dụng chống oxy hóa, chúng tôi tiến hành thực hiện đề [...]...tài: Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan của hạt Vải (Semen Litchi chinensis)’’ với 3 mục tiêu sau: 1 Khảo sát thành phần hóa học của hạt Vải 2 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan 3 Phân lập đƣợc 2- 3 chất 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố của chi Litchi Sonn 1.1.1 Vị trí phân loại chi Litchi Sonn Chi Litchi Sonn là... dụng theo y học hiện đại Tác dụng sinh học của hạt Vải đƣợc đề cập đến nhiều nhất là các tác dụng chống oxy hóa, chống ung thƣ, hạ glucose huyết Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc phân lập các chất từ dƣợc liệu, sau đó thử tác dụng sinh học của các chất phân lập đƣợc Một số tác dụng đáng chú ý nhƣ: a Tác dụng chống oxy hóa [33], [46] Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập đƣợc một... peroxydation, total antioxidant đối với các dịch chiết từ hạt Vải: ethanol, 50% ethanol, methanol, 50% methanol, nƣớc Kết quả cho thấy dịch chiết 50% ethanol có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [45] Ngoài ra, tác dụng chống oxy hóa còn đƣợc báo cáo ở phần cùi Vải ( lớp áo hạt) và vỏ quả Vải [33], [50] Nghiên cứu in vitro trên thử nghiệm DPPH, các polysaccaris trong thành phần của cùi Vải có tác dụng. .. quả có độ chính xác cao Dựa vào kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa, kết hợp với kết quả nghiên cứu thành phần hóa học, lựa chọn phƣơng pháp chiết xuất thích hợp để phân lập chất tinh khiết 2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 2.3.3.1 Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học theo phƣơng pháp nghiên cứu hóa thực vật và hóa học cây thuốc [4], [5],... liệu đƣợc thu hồi dung môi, bảo quản trong tủ lạnh dùng cho việc xác định hoạt tính chống oxy hóa Kết quả thử nghiệm thu đƣợc sẽ định hƣớng cho các nghiên cứu hóa học và tác dụng sinh học kế tiếp 2.3.2.2 Chiết xuất cho nghiên cứu thành phần hóa học và phân lập các chất Chiết xuất cho nghiên cứu thành phần hóa học: Sử dụng các quy trình 19 chiết chuyên biệt dựa vào độ tan của các chất trong dung môi... anthocyanidin, sau đó thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm DPPH, TEAC Kết quả cho thấy 3 chất: 2a,3a-epoxy-5,7,3’,4’tetrahydroxyflavan-(4b-8-catechin);2a,3a-epoxy-5,7,3’,4’-etrahydroxyflavan(4b-8)-epicatechin;2b,3b-epoxy-5,7,3’,4’-tetra-hydroxyflavanm-(4a-8epicatechin) có tác dụng chống oxy hóa ở mức độ trung bình [51] Một nghiên cứu khác thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với... 3-rutinosde và quercetin-3-glucosid đã đƣợc xác định là những anthocyanins quan trọng Flavanol và anthocyanins của vỏ quả cho hoạt động chống oxy hóa rất tốt b Tác dụng chống ung thư Quả Vải chứa một lƣợng lớn các flavanoid và proanthocyanidin Vỏ quả của nó đã đƣợc chứng minh có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ vú và gan [39] Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập đƣợc: Litchiosid... của gan và thận trong T2DR-IR [37] d Tác dụng ức chế tyrosinase Thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên in vitro đối với các dịch chiết từ hạt Vải: ethanol, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nƣớc Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh nhất [45] e Một số tác dụng khác nhƣ tác dụng bảo vệ gan, chống viêm, kháng khuẩn cũng đã đƣợc một số nghiên cứu báo cáo [20], [21], [23], [48]... Phương pháp nghiên cứu tác dụng sinh học 2.3.4.1 Phương pháp sàng lọc khả năng chống oxy hóa in vitro - Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH Phƣơng pháp đƣợc thực hiện theo Blois et al (1958) [57] * Nguyên tắc của phương pháp 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dƣợc 21 liệu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện... Trung Quốc, Thái Lan, Zanzibar [56] Hình 1.1 Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới 1.2.2 Thành phần hóa học của cây Litchi chinensis Sonn Cho tới nay thành phần hóa học của cây Vải (Litchi chinensis Sonn.) đã đƣợc nhiều nghiên cứu công bố Các nhà khoa học chủ yếu tập trung vào nghiên cứu nhóm chất là các polyphenol, saponin, terpenoid Trong đó các 5 chất chủ yếu phân lập đƣợc là các flavonoid, . dụng hạt Vải trong y học và góp phần tìm kiếm nguồn Dƣợc liệu có tác dụng chống oxy hóa, chúng tôi tiến hành thực hiện đề 2 tài: Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và bảo. chống oxy hóa và bảo vệ gan của hạt Vải (Semen Litchi chinensis)’’ với 3 mục tiêu sau: 1. Khảo sát thành phần hóa học của hạt Vải. 2. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan. 3. Phân lập. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải 37 3.4. Kt qu kho sát tác dng chng oxy hóa và bo v gan 45 3.4.1.Chiết xuất để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa 45 3.4.2.Thử nghiệm