BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 173.113 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 173.113 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Cao Văn Thu HÀ NỘI 2014 Lời cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo – PGS.TS Cao Văn Thu người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và làm việc tại bộ môn Vi sinh - Sinh học trường đại học Dược Hà nội đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi làm luận văn tại bộ môn. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Do thời gian thực nghiệm hạn hẹp, điều kiện trang thiết bị, phương tiện nghiên cứu cũng như trình độ của bản thân còn hạn chế, luận văn này không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và bạn bè để luận văn này có thể được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học viên Phan Thị Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………………… CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………………………… 1.1. Đại cương về Streptomyces……………………………………………………… 1.1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces ……………………………… 1.1.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces……………………… 1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn………………… 1.1.4. Những điểm lưu ý khi nghiên cứu các chất kháng sinh từ xạ khuẩn…… 1.2. Bước đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 173.113 1.3. Nghiên cứu tổng hợp Actinomycin X 2 từ Streptomyces 15.29 – Streptomyces microflavus…………………………………………………………………………………… 1.4. Công nghệ lên men Daunorubicin và Adriamycin……………………………. 1.5. Tổng hợp cirramycin B từ Streptomyces cyaneus…………………………………. 1.6. Kháng sinh chống nấm non-polyen từ Streptomyces albidoflavus………………. 1.7. Tổng hợp kháng sinh antimycin A9 từ Streptomyces Sp. K01-0031 …………… 1.8. Sparsomycin kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces Sp. AZ-NIOFD1……. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………. 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị …………………………………………………… 2.1.1. Nguyên vật liệu…………………………………………………………… 2.1.2. Máy móc thiết bị…………………………………………………………. 2.2. Phương pháp thực nghiệm …………………………………………………… 2.2.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn…………………………………………. 2.2.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán………… 2.2.3. Sàng lọc ngẫu nhiên……………………………………………………… 2.2.4. Đột biến bằng ánh sáng UV……………………………………………… 2.2.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh …………………………………… 2.2.6. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ ……………… 2.2.7. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng……………. 2.2.8. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay chân không………… 1 2 2 2 3 4 5 5 6 7 9 9 10 12 14 14 14 16 16 16 17 18 18 20 20 21 22 2.2.9. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột………………………………… 2.2.10. Xác định cấu trúc hóa học thành kháng sinh chính tinh khiết thu được…… CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT…………………… 3.1. Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn……………………………………………… 3.1.1. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên …………………………………………… 3.1.2. Kết quả đột biến lần thứ nhất …………………………………………… 3.1.3. Kết quả đột biến lần thứ hai …………………………………………… 3.2. Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tốt nhất…………………… 3.2.1. Kết quả chọn chủng lên men …………………………………………… 3.2.2. Khảo sát chọn môi trường lên men chìm…………………………………. 3.2.3. Kết quả lên men, chiết và cất quay thu kháng sinh thô……………………. 3.2.4. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ nhất………………………………… 3.2.5. Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ hai…………………… 3.2.6. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ hai……………………………………. 3.2.7. Khảo sát hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ ba………………………. 3.2.8. Kết quả tinh chế kháng sinh lần thứ ba……………………………………… 3.3. Nghiên cứu tính chất, cấu trúc kháng sinh…………………………………………. 3.3.1. Kết quả đo độ nóng chảy……………………………………………………. 3.3.2. Kết quả phổ tử ngoại ………………………………………………………. 3.3.3. Kết quả phổ hồng ngoại ……………………………………………… 3.3.4. Kết quả đo phổ khối ………………………………………………………. 3.3.5. Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân ………………………………… CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ………………………………………………………… 4.1. Chọn lọc và cải tạo giống xạ khuẩn …………………………………………… 4.2. Xác định điều kiện lên men, chiết tách kháng sinh tối thích …………………. 4.3. Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh ………………………………………………. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 22 23 24 24 24 25 27 29 29 31 32 32 35 37 39 40 43 43 43 44 46 46 49 49 50 52 54 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Giá trị MIC và MFC của kháng sinh từ Streptomyces. albidoflavus ………… Bảng 1.2: Giá trị MIC của các antimycin trên Caenorhabditis elegans và Artemia salina ………………. Bảng 2.1: Các vi sinh vật kiểm định ……………… Bảng 2.2.: Các MT nuôi cấy VSV kiểm định…………………………………… Bảng 2.3.: Các dung môi sử dụng……………………………………………………… Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên ……………… Bảng 3.2.: Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ nhất………………………… Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS đột biến lần 1 ……………… Bảng 3.4.: Tính toán tỷ lệ sống sót sau đột biến lần thứ hai………………………… Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS đột biến lần 2 ……………… Bảng 3.6: Kết quả chọn chủng lên men …… ………… Bảng 3.7.: Kết quả chọn môi trường lên men…………………………………… Bảng 3.8: Kết quả sắc ký cột lần thứ nhất ……… ………… …………… Bảng 3.9: Kết quả SKLM các phân đoạn chạy cột lần 1 ………………. Bảng 3.10: Kết quả SKLM các phân đoạn khảo sát dung môi tinh chế KS lần 2 … Bảng 3.11: Tỷ lệ các thành phần hệ dung môi Ethylacetat: methanol: n-hexan ………… Bảng 3.12: Kết quả SKLM với các hệ dung môi Ethylacetat: methanol: n-hexan …… Bảng 3.13: Kết quả thử hoạt tính KS của các phân đoạn sau tinh chế lần 2 ……………… Bảng 3.14: Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ hai ……………… Bảng 3.15: Thành phần các hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần 3 ………………. Bảng 3.16.: Kết quả SKLM với các hệ dung môi tinh chế kháng sinh lần thứ 3………. Bảng 3.17.: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau tinh chế lần 3…………………… Bảng 3.18.: Kết quả SKLM các phân đoạn sau tinh chế lần thứ 3…………………… Bảng 3.19.: Biện giải các nhóm chức của KS1 từ phổ IR……………………………… Bảng 3.20.: Biện giải các nhóm chức của KS2 từ phổ IR……………………………… Bảng 3.21.: So sánh phổ NMR của KS2 với khung phenoxazone của actinomycin D 10 11 14 15 15 24 25 26 28 28 30 31 33 34 36 36 37 38 38 40 40 41 42 44 45 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 : Một số kháng sinh được tổng hợp từ Streptomyces …………………3 Hình 1.2 : Sơ đồ lên men tổng hợp kháng sinh …………………4 Hình P1 : Phổ UV của chất kháng sinh KS1 Hình P2 : Phổ UV của chất kháng sinh KS2 Hình P3 : Phổ IR kháng sinh KS1 Hình P4 : Phổ IR kháng sinh KS2 Hình P5 : Phổ khối MS kháng sinh KS1 Hình P6 : Phổ khối MS kháng sinh KS2 Hình P7 : Phổ 1 H NMR của kháng sinh KS2 Hình P7a, b, c: Phổ 1 H NMR giãn của kháng sinh KS2 Hình P8 : Phổ 13 C NMR của kháng sinh KS2 Hình P8a, b, c : Phổ 13 C NMR giãn của kháng sinh KS2 Hình P9 : Phổ COSY của kháng sinh KS2 Hình P9a, b, c : Phổ COSY giãn của kháng sinh KS2 Hình P10 : Phổ DEPT của kháng sinh KS2 Hình P10a, b : Phổ DEPT giãn của kháng sinh KS2 Hình P11 : Phổ HSQC của kháng sinh KS2 Hình P11a, b : Phổ HSQC giãn của kháng sinh KS2 Hình P12 : Phổ HMBC của kháng sinh KS2 Hình P12a, b, c, d : Phổ HMBC giãn của kháng sinh KS2 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Với tính chất là một nước có khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, Việt Nam nằm trong số các nước có nhu cầu sử dụng kháng sinh rất cao. Tuy nhiên, trên thị trường dược phẩm nước ta hiện nay, hầu hết các thuốc kháng sinh đều được nhập khẩu ở dạng thành phẩm hoặc bán thành phẩm, ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh chưa thực sự hình thành. Vì vậy, đề án “Quy hoạch chi tiết phát triển công nghiệp Dược Việt Nam giai đoạn đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” đã xác định đẩy mạnh việc sản xuất nguyên liệu kháng sinh thế hệ mới đáp ứng nhu cầu về nguyên liệu để sản xuất kháng sinh trong nước [4]. Tổng hợp hoá học, bán tổng hợp và sinh tổng hợp là ba hướng phát hiện và tổng hợp kháng sinh. Trong đó sinh tổng hợp kháng sinh với nhiều ưu điểm được sử dụng chủ yếu để tìm ra kháng sinh mới. Trong tất cả kháng sinh được biết đến hiện nay, có tới 55% kháng sinh được phân lập từ xạ khuẩn, 75% trong số đó từ chi Streptomyces [8, 23]. Bộ môn Vi sinh – Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội đã đầu tư nghiên cứu và phát hiện nhiều chủng xạ khuẩn phân lập từ đất, bùn, … có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, trong đó có chủng xạ khuẩn Streptomyces 173.113. Bước đầu nghiên cứu cho thấy Streptomyces 173.113 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, tuy nhiên hiệu suất tổng hợp cũng như hiệu suất tinh chế chưa cao, chưa biện giải được cấu trúc hóa học của kháng sinh thu được [7]. Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 173.113” làm luận văn thạc sĩ với các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất lên men sinh tổng hợp kháng sinh. 2. Nâng cao khả năng lên men, tách chiết, tinh chế kháng sinh. 3. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh chính thu được. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Đại cƣơng về Streptomyces 1.1.1. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces Các loại xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp. Trong tổng số các kháng sinh đã được tìm thấy do xạ khuẩn tổng hợp thì có tới 75% là từ Streptomyces [8, 23]. - Đặc điểm hình thái: hệ sợi của xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh: + Khuẩn ty cơ chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, không phân cắt trong suốt quá trình phát triển, bề mặt nhẵn hoặc sần sùi, có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ. + Khuẩn ty khí sinh: do khuẩn ty cơ chất phát triển dài ra trong không khí. Sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào từ. + Chuỗi bào tử (sợi bào tử) có rất nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu, xoắn… Chuỗi bào tử phân chia tạo thành các bào tử trần, là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn. Bề mặt bào tử có thể có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) hoặc có tóc (sp). - Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, khử nitrat thành nitrit. Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30°C, pH tối thích thường là 6,8-7,5. 3 - Khả năng tạo sắc tố: Sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid [1, 3, 5, 27]. 1.1.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces Trong số các kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp được biết đến hiện nay thì phần lớn được tổng hợp từ Streptomyces. Các chất kháng sinh được tổng hợp từ xạ khuẩn bao gồm các chất chống nâm, các chất kháng sinh, và hóa chất trị liệu hóa học trong ung thư. Hình 1 dưới đây giới thiệu một số kháng sinh, trong đó phần lớn là do Streptomyces tổng hợp [2, 8, 23]. Hình 1.1: Một số kháng sinh đƣợc tổng hợp từ Streptomyces [...]... vậy, nghiên cứu bước đầu đã tiến hành sàng lọc, đột biến để thu được biến chủng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao hơn, và đã tách chiết được thành phần kháng sinh chính trong quá trình lên men Tuy nhiên, hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh chưa cao, quá trình tinh chế kháng sinh chưa xác định được kháng sinh đã tinh khiết hay chưa, do đó cần tiếp tục nghiên cứu để nâng cao khả năng sinh tổng hợp, ... trên cả vi khuẩn Gram dương và Gram âm, có tiềm năng trong việc ứng dụng trong lĩnh vực phòng và chữa bệnh Tuy nhiên, hoạt tính kháng sinh chưa cao, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh còn thấp, do đó cần phải tiến hành cải tạo giống lựa chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao và nghiên cứu phương pháp tinh chế kháng sinh thu được hiệu suất cao nhất Qua sàng lọc ngẫu nhiên, và đột biến bằng... đoạn sinh trưởng, phát triển, xạ khuẩn thường chuyển sang giai đoạn tự phân, do đó trong quá trình sản xuất phải lưu ý đến thời gian thu nhận sản phẩm [8] 1.2 Bƣớc đầu nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 173. 113 Streptomyces 173. 113 được bộ môn Vi sinh – Sinh học – trường ĐH Dược Hà Nội phân lập từ đất Tây Nguyên Đây là môt chủng xạ khuẩn ổn định, có khả năng tổng hợp kháng sinh. .. Phân tích phổ cộng hưởng từ kết hợp với các thông số trên có thể kết luận kháng sinh chính sinh tổng hợp từ Streptomyces Sp AZ-NIOFD1 là sparsomycin 12 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của kháng sinh này thấy nó có khả năng ức chế Gram dương ( MIC dao động từ 11,7 đến 31,25 µg/ml), Gram âm ( MIC dao động từ 11,7 đến 15,6 µg/ml) [19] 13 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và... 9 S K Augustine và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp một kháng sinh chống nấm non – polyen từ Streptomyces albidoflavus PU23 Lượng kháng sinh thu được từ Streptomyces albidoflavus PU23 cao nhất là vào ngày thứ 8 của quá trình nuôi cấy Dịch lên men được chiết bằng n-hexan, sau đó bốc hơi thu hổi dung môi thu được kháng sinh thô Các thành phần trong kháng sinh thô này được phân tách bằng sắc ký...1.1.3 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn Các bước cơ bản trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn được thể hiện trong hình 1.2 dưới đây Giống truyền ủ trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trong phòng thí nghiệm Bình nhân giống trên thiết bị nhân giống Bình lên men tạo kháng sinh Dịch lên men Sinh khối Dịch lọc Sinh khối thô Dịch chiết kháng sinh Dịch chiết sinh khối... chế, và độ tinh khiết của kháng sinh chính thu được 1.3 Nghiên cứu tổng hợp Actinomycin X2 từ Streptomyces 15.29 – Streptomyces microflavus Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ở Việt Nam, tại phòng thí nghiệm vi sinh, bộ môn Vi sinh sinh học trường ĐH Dược Hà Nội 6 Tiến hành phân loại Streptomyces 15.29 theo ISP thì thấy 92,68% các đặc điểm trùng khớp với Streptomyces sinensis Tuy... được lắc ở nhiệt độ 28°C ± 0,1°C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h Để chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: giống cấp 1 trên MT1dt được lên men trên môi trường tối thích cho việc sinh tổng hợp kháng sinh, sau đó lựa chọn chủng cho dịch lên men có HTKS tốt nhất 2.2.6 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ - Mục đích: Xác định dung môi và pH chiết tối ưu cho... vô trùng, người ta rất quan tâm đến việc nghiên cứu phát triển phương pháp lên men trên môi trường xốp để sinh tổng hợp enzyme, các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học khác Xạ khuẩn có cấu tạo giống vi khuẩn, nhưng thời gian sinh trưởng phát triển chậm hơn vi khuẩn Do đó, thời gian sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp các chất kháng sinh thường kéo dài đến 96 -120 giờ lên men Hầu... actinomycin X2, một hợp chất cũng được phân lập từ chủng Streptomyces spp và có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng sinh rất mạnh [16, 17, 20] 1.4 Công nghệ lên men Daunorubicin và Adriamycin Daunorubicin và Adriamycin là các kháng sinh có hoạt tính chống ung thư từ các xạ khuẩn chi Streptomyces Daunorubicin được sinh tổng hợp từ chủng S peucetius và S.coeruleorubidus có độ độc cao nên ngày nay . Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces Trong số các kháng sinh do xạ khuẩn tổng hợp được biết đến hiện nay thì phần lớn được tổng hợp từ Streptomyces. Các chất kháng sinh được tổng. chưa cao, chưa biện giải được cấu trúc hóa học của kháng sinh thu được [7]. Bởi vậy, chúng tôi lựa chọn đề tài Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 173. 113 . kháng sinh, trong đó có chủng xạ khuẩn Streptomyces 173. 113. Bước đầu nghiên cứu cho thấy Streptomyces 173. 113 có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh phổ rộng, tuy nhiên hiệu suất tổng hợp cũng