BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN 6-MONOACETYLMORPHIN TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013  1  2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN 6-MONOACETYLMORPHIN TRONG MẪU NƯỚC TIỂU BẰNG GC-MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Xuân Trường HÀ NỘI 2013 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ Dược học, em xin được gửi lời trân trọng cảm ơn tới thầy hướng dẫn TS. Nguyễn Xuân Trường. Cám ơn sự tận tình chỉ bảo, cũng như sự động viên của thầy đã giúp em vượt qua những khó khăn để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Sự hiểu biết sâu sắc của thầy đã thắp sang tình yêu khoa học cho mỗi học viên may mắn được thầy hướng dẫn. Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, đặc biệt các thầy cô trong bộ môn kiểm nghiệm thuốc- độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt khóa học. Tôi xin được cảm ơn tới các anh chị đồng nghiệp nơi tôi công tác, cùng các anh chị công tác tại Trung tâm Giám định ma túy-Viện Khoa học Hình sự, đặc biệt là Th.s Đỗ Duy Nam, Th.s Hoàng Ngọc Mai đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, chồng, em trai đã động viên, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt khóa học. Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Minh Nguyệt   3 MỤC LỤC  ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Vài nét về các nhóm ma túy 3 1.1.1 Một số khái niệm về chất ma túy 3 1.1.2.Phân loại các chất ma túy 4 1.2. Các chất ma túy nhóm opiat 5 1.2.1. Lịch sử 5 1.2.2. Cấu trúc, và tác dụng của các chất nhóm opiat [ 5] 5 1.3. Chất chuyển hóa 6-M AM 11 1.3.1. Cấu tạo, tính chất 6-MAM 11 1.3.2. Các phương pháp phân tích 6-MAM. 14 1.4. Kĩ thuật chuẩn bị mẫu 24 1.4.1. Kiểm tra sơ bộ 24 1.4.2. Tách chiết mẫu 25 1.4.3. Dẫn xuất hóa mẫu phân tích 25 1.4.4. Chất nội chuẩn 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHI ÊN CỨU 27 2.1. Đối tượng nghiên cứu 27 2.2. Hóa chất và thiết bị: 27 2.3. Phương pháp và nội dung nghiên cứu 27 2.3.1. Điều kiện làm việc của hệ sắc ký khí – khối phổ (GC-MS) 27 2.3.2. Khảo sát chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết 28 2.3.3. Thẩm định phương pháp định lượng 6- MAM trong nước tiểu bằng GC- MS 29 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 32  4 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ 33 3.1. Xây dựng quy trình chiết, phân tích 6-MAM trong nước tiểu 33 3.1.1. Lựa chọn điều kiện phân tích 6-MAM trên GC-FID 33 3.1.2. Khảo sát lựa chọn dung môi chiết 34 3.1.3. Khảo sát lựa chọn pH môi trường chiết xuất 6-MAM trong mẫu nước tiểu 38 3.1.4. Khảo sát sự ổn định 6-M AM trong mẫu nước tiểu 40 3.1.5. Lựa chọn điều kiện dẫn xuất 6-MAM và phân tích trên GC-MS trong mẫu nước tiểu 44 3.1.6. Quy trình phân tích 6-MAM trong mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng- lỏng, dẫn xuất hóa và phân tíc h trên GC-MS 47 3.2. T hẩm định phương pháp định lượng 6-MAM trong nước tiểu bằng GC-MS 49 3.2.1. Khảo sát tính chọn lọc, đặc hiệu 49 3.2.2 Đường chuẩn, khoảng làm việc, Giới hạn phát hiện ( LOD) , ngưỡng phát hiện (Cut off) 51 3.2.3. Độ đúng 53 3.2. 4. Độ chính xác 54 3.2.5. Độ thu hồi 55 3.3. Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu thực tế 56 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 60 4.1 Về thẩm định phương pháp phân tích 6-MAM trong nước tiểu 60 4.2 Về phân tích mẫu thực tế 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63    5 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT/ KÝ HIỆU  6 – MAM 6 – monoacetylmorphine AC Acetylcodein BSA N, O-bis-trimethylsilylacetamit BSTFA N, O-bis-trimethylsilyifluoroacetamide Clof Chloroform DCM Dichlorometan Ete Diethylete EI Kỹ thuật ion hóa bằng va chạm electron EtAc Ethylacetat GC-MS Sắc ký khí – khối phổ HPLC (High performance liquid Chromatography) Sắc ký lỏng hiệu năng cao IS (Internal Standard) Chất nội chuẩn LOD (Limit of Detection) Giới hạn phát hiện LOQ (Limit of Quantification) Giới hạn định lượng M-3-G Morphin – 3 – glucuronic M-6-G Morphin – 6 – glucuronic PFPA Anhydric pentafluoropropionic RSD Phương sai SD Độ lệch chuẩn  6 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Morphin 6 Hình 1.2. Sơ đồ chuyển hóa của các chất nhóm opiat 10 Hình 1.3. Công thức cấu tạo 6-MAM 11 Hình 1.4. Sơ đồ máy khối phổ 21 Hình 1.5. Sơ đồ quá trình i on hóa bằng EI 22 Hình 1.6. Sơ đồ bẫy ion tứ cực 24 Hình 3.1: Phổ đồ của hỗn hợp chất chuẩn m ethadone, morphine, 6-MAM, Octacosan trong CTSK GC-FID 34 Hình 3.2: Phổ đồ GC của mẫu c hiết bằng chloroform trong trường hợp không loại tạp 36 Hình 3.3 : Phổ đồ GC của mẫu c hiết bằng chloroform trong trường hợp đã loại tạp 36 Hình 3.4: Biểu đồ biểu thị hiệu suất chiết 6-MAM của các dung m ôi 37 Hình 3.5: Đồ thị biểu thị khả năng chiết 6-MAM trong nước t iểu ở các giá trị pH 39 Hình 3.6: Phổ đồ GC của mẫu c hiết với chloroform ở pH=9 40 Hình 3.7: Phổ đồ GC của mẫu c hiết trong ngày đầu 41 Hình 3.8: Phổ đồ GC của mẫu c hiết trong ngày thứ 5 42 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi nồng độ 6-M AM trong thời gian bảo quản 42 Hình 3.10: Sơ đồ phản ứng dẫn xuất 6-MAM + PFP A 44 Hình 3.11: Sự thay đổi hình dạng, chiều cao, thời gian lưu pic khi dẫn xuất: 6-MAM cho pic tại 11,92 phút và 6-MAM-PFP cho pic tại 10,67 phút 46 Hình 3.12: Đồ thị đường chuẩn định lượng 53 Hình 3.13: Phổ đồ kết quả phân tích của mẫu M03 59  7 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Công thức cấu tạo của các chất nhóm opiat 6 Bảng 3.1: Kết quả khảo sát dung m ôi chiết trong trường hợp đã loại tạp 37 Bảng 3. 2: Kết quả khả năng chiết 6-MAM trong nước tiểu phụ thuộc vào pH mẫu 39 Bảng 3.3: Kết quả sự thay đổi tỷ lệ diện tích pic của 6-MAM và chất nội chuẩn trong quá trình bảo quản mẫu nước tiểu 41 Bảng 3.4: Kết quả hiệu suất chiết 6-MAM theo quy trình đã lựa chọn 43 Bảng 3.5: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống 51 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát xây dựng đường chuẩn, xác định LOD, LOQ 52 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát xác định độ đúng 54 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp 56 Bảng 3.9: Một số thông tin ban đầu về mẫu nước tiểu thực tế 57 Bảng 3.10: Kết quả phân tích mẫu thực tế 58  8 ĐẶT VẤN ĐỀ  Ma túy là một vấn nạn, không chỉ trong nội bộ của một quốc gia mà còn là vấn đề cần được quan tâm của nhiều nước. Toàn cầu hóa đã mang lại nhiều cơ hội cho sự phát triển kinh tế- xã hội, song cũng đặt ra nhiều thách thức lớn trong công cuộc đấu tranh với tệ nạn ma túy, đặc biệt ở các nước đang phát triển. Hiện nay, do mức độ nghiêm trọng từ phương thức đến t hủ đoạn sản xuất, vận chuyển, buôn bán ma tuý ngày càng tinh vi đã ảnh hưởng không nhỏ đến công tác quản lý, đấu tranh ngăn chặn ma túy của các nước. Cũng như các quốc gia khác trong khu vực và quốc tế, Việt Nam đã có nhận thức sâu sắc về tác hại của ma túy đối với cá nhân, cộng đồng và xã hội. Việc đấu tranh phòng, chống ma túy ở Việt Nam là một mặt trận nóng bỏng, được cả xã hội q uan tâm. Quốc hội Việt Nam đã thông qua Luật phòng, chống ma túy năm 2001, Luật sửa đổi, bổ sung một số điều của Luật phòng, chống ma túy năm 2008. Chính phủ Việt Nam đã tập trung chỉ đạo thực hiện các luật, nghị quyết của Quốc hội, ban hành được nhiều văn bản hướng dẫn thi hành pháp luật về phòng, chống ma túy, cũng như đã thành lập Ủy ban Quốc gia về phòng, chống ma túy. Trong những năm qua, việc phòng, chống ma tuý tại Việt Nam đã đạt được những kết quả quan trọng. Tuy vậy, tệ nạn ma túy vẫn diễn biến phức tạp và tiếp tục gây ra các hậu quả nghiêm trọng, ảnh hưởng đến chiến lược phát triển kinh tế, trật tự, an toàn xã hội và phát triển nòi giống. Điều này đòi hỏi Việt Nam cần tiếp tục có các giải pháp đồng bộ trong việc đấu tranh ngăn chặn các tệ nạn và tội phạm liên quan đến ma túy. Một trong những biện pháp hỗ trợ cho công tác phòng ngừa là phát hiện, đánh giá mức độ sử dụng ma túy của các đối tượng sử dụng các chất ma túy [2]. Theo thời gian, các đối tượng sử dụng chất ma túy ngày càng đa dạng, tinh vi hơn. Điều này thể hiện không chỉ trong việc tàng trữ, sử dụng các chất  1 ma túy mà còn trong quá trình khai báo khi bị bắt. Một số thuốc có sản phẩm chuyển hóa giống sản phẩm chuyển hóa của một số chất ma túy, điều này thường được các đối tượng lợi dụng trong quá trình khai báo nhằm thoát tội. Vì vậy công tác phát hiện các chất ma túy đòi hỏi ngày càng hoàn thiện hơn khắc phục những lỗ hổng mà tội phạm có thể lợi dụng được [2], [9]. Heroin là một trong những chất ma túy nguy hiểm nhất và phổ biến nhất trên thế giới, cũng như ở Việt Nam. Heroin được bán tổng hợp từ Morphine. Khi vào cơ thể, một trong những sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của heroin được tìm thấy là Morphine, đây cũng là sản phẩm chuyển hóa của một số thuốc chứa hoạt chất codein, morphine, opium. Vì vậy khi phát hiện Morphintrong dịch sinh học không thể kết luận đối tượng đã sử dụng Heroin. 6-Monoacetylmorphin(6-MAM) là sản phẩm chuyển hóa trung gian của Heroin trong cơ thể, đồng thời cũng là “chìa khóa” để phân biệt Heroin với các opiat khác. Tuy nhiên, nồng độ của 6-MAM trong nước tiểu thường rất nhỏ, cần có những thiết bị phân tích hiện đại, có độ nhạy cao để nhận dạng. Trên thế giới để xác định việc sử dụng Heroin người ta thường tiến hành phân tích sản phẩm chuyển hóa trung gian 6-MAM. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có công trình nghiên cứu toàn diện về vấn đề này [6] , [11]. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nhiệm vụ “xây dựng phương pháp phát hiện 6-Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng GC-MS” với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phát hiện 6- Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí – khối phổ (GC-MS). 2. Ứng dụng phương pháp phân tích một số mẫu nước tiểu thực tế.  2 [...]... Thắm có xây dựng phương pháp phân tích Heroin, Cocain và các sản phẩm trung gian trong nước tiểu trong đó có 6-MAM bằng GC- MS Khóa luận có phạm vi nghiên cứu rộng, 6-MAM là một trong số nhiều đối tượng nghiên cứu của khóa luận Cũng như một số công trình nghiên cứu khác, cho đến nay ở trong nước chưa có công trình nghiên cứu nào xây dựng và thấm định phương pháp giám định 6-MAM trong mẫu nước tiểu một... biến thiên trong khoảng rộng là do sự khác biệt về lực ion của mỗi hệ đệm sử dụng trong mỗi nghiên cứu khác nhau [16] - Tình hình nghiên cứu 6-MAM trên thế giới Trên thế giới, định lượng 6-MAM trong nước tiểu được thực hiện từ khá lâu Năm 1989, B.D.Paul và các cộng sự đã tiến hành định lượng 6-MAM trong nước tiểu bằng phương pháp GC- MS Năm 1992, P.P Rop và các cộng sự thực hiện phát hiện 6-MAM trong huyết... phụ thuộc vào pH mẫu 6-MAM có chứa nitơ bậc 3 vì vậy mang tính kiềm yếu, khảo sát hiệu suất chiết 6-MAM trong môi trường kiềm, với dãy pH 7,8,9,10,11 bằng các hệ đệm Khảo sát độ ổn định của 6-MAM trong mẫu nước tiểu Thêm 6-MAM vào mẫu nước tiểu trắng và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong phòng thí nghiệm Sau mỗi ngày lấy 15ml chia làm 3 mẫu đem chiết, phân tích 6-MAM trong điều kiện đã lựa chọn trong vòng... tác dụng của nhiệt và chúng ít bị phân hủy bởi nhiệt + GC là phương pháp tách các cấu tử cho độ phân giải cao + Sử dụng GC phân tích mẫu rất kinh tế vì tốn ít dung môi, hóa chất + GC cho độ lặp lại của chỉ số thời gian lưu và diện tích pic cao + Gc sử dụng lượng mẫu rất ít + Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng nhỏ + Việc sử dụng và bảo dưỡng GC không phức tạp   23 So với HPLC, GC có thời gian phân... 6-MAM bị mất đi sau 9 ngày giữ trong môi trường pH 8.6 ở nhiệt độ phòng [23] Paul và các cộng sự cho hay 44% 6-MAM bị mất sau 2 tuần trong nước tiểu (pH =6,8 ), trong khi Barrett và các cộng sự phát hiện 6- MAM không bị thủy phân ở pH 4,0- 7,4 trong cùng điều kiện [22] Fuller và Anderson nhận thấy rằng cần 12 tuần để thủy phân hoàn toàn 6- MAM trong nước tiểu thành morphintrong điều kiện pH 8,0 tại nhiệt... toàn diện [8]   13 1.3.2 Các phương pháp phân tích 6-MAM 1.3.2.1 Phân tích miễn dịch Phân tích miễn dịch là phương pháp được khuyến khích sử dụng để phát hiện sơ bộ Phương pháp này dựa vào độ hoạt động phóng xạ (RIA), hoạt tính men (EIA), độ phân cực huỳnh quang…hạn chế của phương pháp này là tính kháng chéo của các kháng thể sử dụng trong các phương pháp phân tích miễn dịch Trong quá trình phân tích... 6-MAM trong huyết tương, máu, nước tiểu bằng phương pháp HPLC Tuy nhiên về cơ bản phương pháp GC- MS vẫn được sử dụng nhiều hơn cả [22], [24] Xung quanh việc 6-MAM có phải là dấu hiệu đặc hiệu trong phân tích, phát hiện đối tượng sử dụng heroin cũng có nhiều nghiên cứu: Năm 1997, Carol L.O’Neal và Alphonse Poklis nghiên cứu về việc bổ sung acetylcodein (AC) như một dấu hiệu phát hiện người sử dụng heroin... vào 50 µl ethylacetat và tiến hành bơm mẫu Dẫn xuất hóa của PFPA có thể bền vững trong PFPA hàng tháng Sau khi cô đuổi PFPA có thể bảo quản được 24 giờ Cách này thường được sử dụng trong phân tích 6-MAM bằng GC- MS Cách 2: thêm Ether dầu hỏa trifluoroaxetic vào cặn chiết nước tiểu, đậy kín và xử lý ở 550C trong 30 phút Cô bay hơi, sau đó hòa lại vào 50µl ethylacetat và tiến hành bơm mẫu [7], [27], [28]... phát hiện 6-MAM trong nước tiểu ngắn, khoảng 2-8 giờ, nồng độ 6-MAM trong nước tiểu rất thấp so với morphine, vì vậy rất khó để phát hiện Có nhiều tài liệu khác nhau về sự ổn định của 6-MAM trong nước tiểu Rop và các cộng sự cho rằng 6-MAM được thủy phân hoàn toàn trong nước trong vòng 7 ngày ở nhiệt độ phòng, và 9% bị thủy phân sau 14 ngày ở nhiệt độ -200C [24]   11 Poochikian và Cradock thấy rằng hơn... tạp được tìm thấy trong heroin, có lượng thay đổi phụ thuộc vào nguồn gốc heroin, độ ổn định trong nước tiểu cao hơn so với 6-MAM Trong nghiên cứu này độ nhạy của AC với GC- MS cũng rất tốt Giới hạn phát hiện (LOD) của AC là 0,5µg/L, giới hạn định lượng (LOQ) là 1.0µg/L Trong khi   12 đó LOD và LOQ của 6-MAM là 2,0µg/L Tuy nhiên hai tác giả cũng kết luận rằng AC được tìm thấy ở ít mẫu và nồng độ ít hơn . 6- Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng GC- MS với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phát hiện 6- Monoacetylmorphintrong mẫu nước tiểu bằng phương pháp sắc ký khí – khối phổ (GC- MS) trình phân tích 6- MAM trong mẫu nước tiểu bằng chiết lỏng- lỏng, dẫn xuất hóa và phân tíc h trên GC- MS 47 3.2. T hẩm định phương pháp định lượng 6- MAM trong nước tiểu bằng GC- MS 49 3.2.1. Khảo. xuất 6- MAM trong mẫu nước tiểu 38 3.1.4. Khảo sát sự ổn định 6- M AM trong mẫu nước tiểu 40 3.1.5. Lựa chọn điều kiện dẫn xuất 6- MAM và phân tích trên GC- MS trong mẫu nước tiểu 44 3.1 .6.