BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ MỸ HẠNH NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60720402 Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Hân HÀ NỘI 2013 LỜI CẢM ƠN ! Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hân, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện và toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành luận văn đúng thời hạn. Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những tháng năm học tập tại trường. Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời gian qua. Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, tháng 08 năm 2013 Học viên: Phùng Thị Mỹ Hạnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về cây hồi 3 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật 3 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 4 1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng 5 1.1.5. Tinh dầu hồi 6 1.2. Tổng quan về acid shikimic 7 1.2.1. Công thức hóa học và tính chất 7 1.2.2. Kỹ thuật phân tích 8 1.2.3. Nguồn gốc acid shikimic 8 1.2.4. Vai trò acid shikimic 9 1.2.5. Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi 10 1.3. Nhận xét 11 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên vật liệu 13 2.1.1. Nguyên liệu 13 2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Lựa chọn phương pháp chiết xuất 15 2.2.2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước 16 2 3. Phương pháp nghiên cứu 16 2.3.1. Phương pháp định lượng acid shikimic 16 2.3.2. Phương pháp chiết xuất acid shikimic và cất tinh dầu 18 2.3.3. Phương pháp tinh chế acid shikimic 19 2.3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 19 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1. Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi 21 3.2. Khảo sát giai đoạn chiết xuất 22 3.2.1. Chiết xuất theo phương pháp A 22 3.2.2. Chiết xuất theo phương pháp B 25 3.2.3. Đánh giá và lựa chọn phương pháp chiết xuất 29 3.3. Tinh chế acid shikimic 33 3.3.1. Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế 34 3.3.2. Bước đầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa acid shikimic bằng isopropanol 41 3.4. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic và kiểm tra chất lượng sản phẩm 42 3.4.1. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic 42 3.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm 44 3.5. Mở rộng quy mô 48 3.5.1. Mô tả quy trình 48 3.5.2. Kết quả 50 CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN 51 4.1. Về giai đoạn chiết xuất 51 4.2. Về giai đoạn tinh chế 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AC : aceton AS : acid shikimic DD : dung dịch DL : dược liệu EtOH : ethanol IPA : isopropanol MeOH : methanol PP : phương pháp SP : sản phẩm IR : phổ hồng ngoại MS : phổ khối lượng 1 H-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13 C-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.)…… … 3 Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất chiết acid shikimic theo phương pháp A…… 24 Bảng 3.2. Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết sau mỗi giờ theo PP B….27 Bảng 3.3. Kết quả hiệu suất 3 lần chiết acid shikimic bằng PP B………….28 Bảng 3.4. Kết quả xác định hệ số chọn lọc của 2 phương pháp…………….30 Bảng 3.5. Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp…………………… 31 Bảng 3.6. Bảng so sánh tốc độ cân bằng, hiệu suất chiết, hàm lượng AS trong cắn (S), thể tích tinh dầu và thời gian chiết xuất……… 32 Bảng 3.7. Kết quả quá trình tinh chế sử dụng các dung môi tinh chế khác nhau………………… 37 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát liên quan tới hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế……………………………… 42 Bảng 3.9. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại………… 45 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) ……………… 46 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) …….47 Bảng 3.12. Các thông số của quá trình chiết tách và phân lập acid shikimic với cỡ mẻ 2kg………………………………….….48 Bảng 3.13. Kết quả chiết xuất acid shikimic với cỡ mẻ 2kg đại hồi….….….50 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu dược liệu ………………………… … …21 Hình 3.2. Sắc ký đồ của acid shikimic chuẩn……………… ………… …21 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn nồng độ của acid shikimic theo thời gian của PP A……………… ………………….… …23 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình chiết acid shikimic và cất tinh dầu theo PP B……………… ……… ………….…………26 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn nồng độ acid shikimic theo thời gian của PP B 27 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn nồng độ AS theo thời gian của 2 phương pháp 29 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết của 2 phương pháp…………… 30 Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tinh chế acid shikimic sử dụng các loại dung môi……………………………………… 35 Hình 3.9. Hình ảnh sản phẩm thô và sản phẩm tinh chế…… …………… 38 Hình 3.10. Sơ đồ tinh chế acid shikimic…………………………… …… 43 Hình 3.11. Sản phẩm acid shikimic……………………… ……… …… 50 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cây hồi (còn gọi là cây đại hồi, hồi hương, …), tên khoa học Illicium verum Hook. f. là một loài cây phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và khu vực Đông Bắc Việt Nam. Quả chín phơi khô của cây hồi (đại hồi) được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực Trung Hoa, là hương liệu trong sản xuất rượu mùi và nướng bánh ở các nước phương Tây, là một gia vị trong món phở của Việt Nam,… Trong Đông y, dược liệu này chủ trị đau bụng, nôn mửa, đau nhức cơ-khớp do lạnh [4], [5]. Đại hồi còn được biết đến là nguồn nguyên liệu sản xuất acid shikimic, thành phần quan trọng trong bán tổng hợp sản xuất thuốc chống virus điều trị cúm gia cầm type A và type B oseltamivir phosphat (tên thương mại là Tamiflu) [7], [14]. Tamiflu đang được coi là dược phẩm có triển vọng nhất để làm giảm tác hại của bệnh cúm gia cầm – loại bệnh vẫn đang là mối lo ngại và tiềm ẩn nguy cơ bùng phát thành đại dịch cúm đối với con người. Ở Việt Nam và trên thế giới, nhiều nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng dung môi ethanol, methanol, nước… cho hiệu suất khá cao nhưng thao tác thực hiện phức tạp, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, sử dụng dung môi tinh chế độc hại (methanol, formaldehyd,…) và hầu hết bỏ qua vấn đề khai thác tinh dầu [6], [8], [10], [12], [22], [24], [25]. Giá trị của đại hồi bị giảm đáng kể vì được sử dụng chủ yếu để lấy tinh dầu mà bỏ qua acid shikimic. Thực tế ở Việt Nam, đại hồi cũng chỉ dùng để cất lấy tinh dầu mà chưa tận thu được hoạt chất này. Trong khi đó, acid shikimic do Việt Nam sản xuất lại có giá thành cao hơn acid shikimic do Ấn Độ sản xuất – quốc gia phải nhập đại hồi. Đã có nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra nguồn acid shikimic từ các phương pháp tổng hợp hóa học hay lên men vi sinh,… tuy nhiên hiệu suất không cao và giá cả không thể cạnh tranh với phương pháp chiết xuất từ dược liệu [8], [15], [16]. 2 Đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi” được thực hiện nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi đạt các tiêu chí: quy trình thao tác đơn giản, an toàn, chi phí thấp và kết hợp thu tinh dầu; từ đó có thể triển khai áp dụng trong điều kiện thực tế tại Việt Nam ở quy mô lớn hơn. Mục tiêu nghiên cứu đặt ra gồm có: 1. Khảo sát và lựa chọn được phương pháp chiết xuất acid shikimic kết hợp thu tinh dầu từ đại hồi với dung môi nước. 2. Xây dựng được phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước. [...]... NGHIấN CU 3.1 Hm lng acid shikimic trong i hi Xỏc nh hm lng acid shikimic bng phng phỏp HPLC nh ch dn mc 2.3.1 Hm lng acid shikimic cú trong i hi xỏc nh c l 10,8% 0,1% Sc ký ca mu dc liu v acid shikimic chun c trỡnh by trong hỡnh 3.1 v 3.2 PDA-210 nm shikimic acid duoc lieu.dat Retention Time 200 2.656 mAU 400 0 0 1 2 3 4 5 Minutes Hỡnh 3.1 Sc ký ca mu dc liu PDA-210 nm shikimic acid chuan merk 5.dat... (5%-10%) [8] Acid shikimic cũn cú ngun gc t tng hp hoc bỏn tng hp Raphael (1960) v Smissman (1959) ó tng hp acid shikimic t 1,3butadien-1,4-diyl diacetate qua phn ng Diels Alder Grewe (1964) v cng s tng hp acid shikimic t 1,3-butadien Ngoi ra, acid shikimic cú th c tng hp t benzen, bỏn tng hp t acid quinic v D-manose [15] Giỏo s Frost, trng i hc Michigan, ó nghiờn cu cụng ngh sn xut acid shikimic bng... dung dch th a: hm lng acid shikimic trong mu chun Hiu sut chit xut: HC % HLA/dc HLA/dl 100% 2 Trong ú: HC%: hiu sut chit xut HLA/dc: hm lng acid shikimic trong dch chit HLA/dl: hm lng acid shikimic trong dc liu Hiu sut c quỏ trỡnh: H % mSP 100% mT 3 Trong ú: H%: hiu sut c quỏ trỡnh mSP: khi lng sn phm mT: khi lng acid shikimic cú trong dc liu em chit 2.3.2 Phng phỏp chit xut acid shikimic v ct tinh... mc 25mL, thờm nc n vch, lc u Lc qua mng 0,45àm - Mu th l dch chit: Pha loóng dch chit n nng acid shikimic trong khong 50 150àg/mL, lc qua mng 0,45àm 2.3.1.3 Cụng thc tớnh Hm lng acid shikimic trong i hi: X% m a.V f S T T T 100% C m V f S T C C C Trong ú: X%: hm lng acid shikimic trong i hi mC: Khi lng acid shikimic chun mT: Khi lng i hi em chit 17 1 SC: Din tớch peak mu chun ST: Din tớch peak mu... hp th: Dung dch acid shikimic trong ethanol cú cc i hp th 213 nm 1.2.2 K thut phõn tớch Denis V Bochkov v cs ó trỡnh by cỏc k thut phõn tớch acid shikimic trong bi tng quan v hp cht ny [17] Cỏc k thut c nờu ra gm cú: - Sc ký giy - o ph cng hng t ht nhõn - Phn ng mu - Sc ký lng hiu nng cao pha o - K thut phõn tớch nh lng - Mt s k thut phõn tớch khỏc 1.2.3 Ngun gc acid shikimic Acid shikimic c Eykman... 61% v c xem l phng phỏp ti u nht hin nay [14] 1.2.5 Mt s nghiờn cu chit xut acid shikimic t i hi Khi i dch cỳm gia cm xy ra, hóng Roche v th gii lo lng vỡ khụng acid shikimic sn xut Nhiu nhúm nghiờn cu ó c gng tỡm ra acid shikimic vi cỏc phng phỏp v nhiu ngun nguyờn liu khỏc nhau Payne R v Edmonds M (2005) tin hnh chit acid shikimic t i hi bng thit b Soxhlet vi dung mụi ethanol 95% Dch chit c ct loi... Kt qu hiu sut chit acid shikimic theo phng phỏp A Th tớch Nng Hiu sut (mL) (%) chit (%) Ln 1 700 26 1,12 0,07 72,5 Ln 2 680 13 0,29 0,01 18,2 Ln 3 640 5 0,13 0,01 7,7 Ln chit Tng hiu sut chit = 98,4% Nhn xột: Hiu sut chit acid shikimic trong dch chit ln 1 l 72,5 %, ln 2 l 18,2%, ln 3 l 7,7% Hiu sut chit acid shikimic sau 3 ln chit l 98,4% 24 Kt qu cho thy phng phỏp chit acid shikimic sau khi ct... c gn nh hon ton lng acid shikimic trong dc liu vi 3 ln chit Nh vy trong quỏ trỡnh ct tinh du acid shikimic hu nh khụng b phõn hy 3.2.1.4 Kho sỏt tớnh chn lc Tin hnh: Dch chit ca 3 ln chit theo mc 3.2.1.3 c gp li Hỳt chớnh xỏc 1mL dch chit cho vo bỡnh nh mc 50mL Thờm nc va n vch, lc k cho u Xỏc nh nng acid shikimic bng phng phỏp HPLC Sau ú cụ n cn, cõn lng cn thu c Hm lng acid shikimic trong cn (S)... chit L2,3 Gp dch chit Dch chit Bó DL Ct tinh du Tinh du Bó DL Hỡnh 3.4 S quy trỡnh chit acid shikimic v ct tinh du theo PP B Kho sỏt phng phỏp B v tc chit, hiu sut chit acid shikimic, tớnh chn lc v th tớch tinh du thu c sau khi ó chit acid shikimic Tin hnh so sỏnh vi phng phỏp A, t ú la chn phng phỏp chit xut acid shikimic cho hiu sut cao 3.2.2.1 Kho sỏt tc chit Kho sỏt thi im cõn bng ca phng phỏp... con ng lờn men vi sinh s dng chng Escherichia coli tỏi t hp, sau ú chit xut acid shikimic t dch lờn men v 8 tinh ch Tuy nhiờn hiu sut khụng cao v giỏ thnh khụng th cnh tranh vi phng phỏp chit xut t i hi [16] 1.2.4 Vai trũ acid shikimic Trong sinh hc núi chung, acid shikimic úng vai trũ quan trng trong quỏ trỡnh sinh tng hp cỏc acid amin thm nh phenylalanin, tryptophan, tyrosin; cỏc alcaloid, hp cht phenolic, . pháp chiết xuất từ dược liệu [8], [15], [16]. 2 Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi được thực hiện nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi. 1.2.5. Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi Khi đại dịch cúm gia cầm xảy ra, hãng Roche và thế giới lo lắng vì không đủ acid shikimic để sản xuất. Nhiều nhóm nghiên cứu đã cố gắng. nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi sử dụng dung môi chiết xuất là nước và kết hợp chưng cất tinh dầu nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi có thể áp