BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG KEM VIEMDA AD BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG KEM VIEMDA AD BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Cán bộ hướng dẫn: 1.PGS.TS. NGUYỄN THỊ KIỀU ANH 2.TS.LÊ THỊ HẢI YẾN HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực, các anh chị kĩ thuật viên, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng sau đại học, các thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Phân tích - Độc chất - Trường ĐH Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, TS. Lê Thị Hải Yến người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ ở Viện công nghệ dược phẩm Quốc Gia, Viện an toàn vệ sinh thực phẩm đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè - những người đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập cũng như trong cuộc sống. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày 27 tháng 8 năm 2014 Nguyễn Thị Quỳnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Dược liệu long đởm 2 1.1.1. Tên khoa học 2 1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố 2 1.1.3. Thành phần hóa học 3 1.1.4. Tác dụng dược lý 4 1.2. Bệnh viêm da cơ địa (Atopic Dermatitis - AD) 5 1.2.1. Giới thiệu khái quát về bệnh viêm da cơ địa 5 1.2.2. Thuật ngữ 6 1.2.3. Một số phương pháp điều trị AD 7 1.3. Chế phẩm kem Viemda AD 8 1.4. Tổng quan về các phương pháp sắc ký 9 1.4.1. Phương pháp HPLC 9 1.4.2. Sắc ký lớp mỏng 13 1.5. Một số phương pháp định lượng và định tính getiopicrin bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao 16 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.2. Hóa chất và thiết bị 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 18 2.3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký 19 2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 20 2.4. Đánh giá kết quả 23 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC 24 3.1.1. Quy trình xử lý mẫu 24 3.1.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký 26 3.1.3. Quy trình phân tích 29 3.2. Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPLC 30 3.2.1. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống 30 3.2.2. Tính chọn lọc - đặc hiệu 30 3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính 32 3.2.4. Độ chính xác 33 3.2.5. Độ đúng 34 3.3. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPTLC 35 3.4. Thẩm định phương pháp định lượng bằng HPTLC 38 3.4.1. Độ thích hợp của hệ thống 38 3.4.2. Độ đặc hiệu 38 3.4.3. Tính tuyến tính 40 3.4.4. Độ chính xác 41 3.4.5. Độ đúng 43 3.4.6. So sánh hai phương pháp 43 3.5. Đề xuất tiêu chuẩn kem Viemda AD 44 Chương 4. BÀN LUẬN 48 4.1. Tính cấp thiết của việc tiêu chuẩn hóa dược liệu ở Việt Nam 48 4.2. Vấn đề lựa chọn phương pháp phân tích 48 4.3. Về xây dựng phương pháp định lượng 49 4.4. Về thẩm định phương pháp định lượng đã xây dựng 50 4.5. Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng kem Viemda AD 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TLC : Thin Layer Chromatograph (Sắc ký lớp mỏng) HPLC : Hight Performance Liquit Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPTLC: Hight Performance Thin Layer Chromatograph (Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) R f : Hệ số di chuyển T R : Thời gian lưu R s : Độ phân giải RSD : Độ lệch chuẩn tương đối AF : Hệ số bất đối xứng Danh mục bảng: Bảng 3.1: Kết quả khảo sát thời gian chiết mẫu 24 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát thời gian đun cách thủy 25 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát thành phần pha động 26 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tốc độ dòng pha động 27 Bảng 3.5: Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống (bằng HPLC) 30 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính (bằng HPLC) 32 Bảng 3.7: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC 33 Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC 35 Bảng 3.9: Giá trị Rf và diện tích vùng đáp ứng của các vết 38 Bảng 3.10: Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của phương pháp HPTLC 40 Bảng 3.11: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPTLC 42 Bảng 3.12: So sánh hàm lượng gentiopicrin(%) của 2 phương pháp 43 Danh mục hình: Hình 1.1: Công thức cấu tạo gentiopicrin 4 Hình 1.2: Chế phẩm kem Viemda AD 9 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tỷ số diện tích pic và khối lượng mẫu (A/m) với thời gian chiết 25 Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn mối liên hệ giữa tỷ số diện tích pic, khối lượng mẫu và thời gian đun cách thủy 25 Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần pha động tới áp suất cột sắc ký 27 Hình 3.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ thành phần pha động tới thời gian lưu của pic gentiopicrin 27 Hình 3.5: Sắc ký đồ gentiopicrin chuẩn ở điều kiện sắc ký đã lựa chọn 28 Hình 3.6: Phổ hấp thụ của gentiopicrin 29 Hình 3.7: Sắc ký đồ mẫu placebo 31 Hình 3.8: Sắc ký đồ mẫu chuẩn gentiopicrin 31 Hình 3.9: Sắc ký đồ mẫu thử (chế phẩm kem Viemda AD) 32 Hình 3.10: Sắc ký đồ dãy chuẩn gentiopicrin ………… 33 Hình 3.11: Sắc ký đồ mẫu thử đánh giá độ chính xác bằng HPLC 34 Hình 3.12: Hình ảnh sắc ký đồ gentiopicrin hệ dung môi khai triển 2 36 Hình 3.13: Giản đồ vết mẫu thử (chế phẩm kem Viemda AD) ở hệ dung môi khai triển thứ 2 37 Hình 3.14: Khảo sát thể tích chấm sắc ký 37 Hình 3.15: Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu bằng HPTLC 38 Hình 3.16: Giản đồ vết mẫu gentiopicrin chuẩn bằng HPTLC 39 Hình 3.17: Giản đồ vết mẫu placebo bằng HPTLC 39 Hình 3.18: Sắc ký đồ mẫu thử (chế phẩm kem Viemda AD) bằng HPTLC 40 Hình 3.19: Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 41 Hình 3.20: Sắc ký đồ mẫu thử đánh giá độ chính xác bằng HPTLC 42 . TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG KEM VIEMDA AD BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC . ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG GENTIOPICRIN TRONG KEM VIEMDA AD BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN. về các phương pháp sắc ký 9 1.4.1. Phương pháp HPLC 9 1.4.2. Sắc ký lớp mỏng 13 1.5. Một số phương pháp định lượng và định tính getiopicrin bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao