Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Bất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù ra đời chưa lâu nhưng nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội so với nhiều phương pháp sử dụng tế bào tự do và so với cả kỹ thuật bất động enzyme – cơ sở của phương pháp bất động tế bào. Sản xuất các chế phẩm sinh học bằng phương pháp bất động tế bào cho năng suất tạo sản phẩm cao hơn, sản phẩm tinh khiết hơn và đặc biệt có thể sản xuất liên tục trong một quá trình tự động hóa. Bất động tế bào đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở quy mô công nghiệp. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose… trong đó protease là enzyme được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Cố định tế bào B. subtilis natto có thể phát huy được các ưu điểm của phương pháp bất động tế bào hướng tới mục tiêu sản xuất enzyme protease. Vì vậy, khóa luận “Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào Bacillus subtilis natto được cố định trong gel alginate” được thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate. 2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt.
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA TẾ BÀO Bacillus subtilis natto ĐƢỢC CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NHUNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CỦA TẾ BÀO Bacillus subtilis natto ĐƢỢC CỐ ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. ThS. Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS. Kiều Thị Hồng và TS. Đàm Thanh Xuân, giảng viên Bộ môn Công nghiệp Dược, những người thầy đã luôn quan tâm, trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi thực hiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới DS. Lê Ngọc Khánh, ThS. Nguyễn Khắc Tiệp đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi thực hiện khóa luận. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dìu dắt, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã động viên, khích lệ, ủng hộ nhiệt thành và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua. Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Nhung MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto: 2 1.1.1. Phân loại khoa học: 2 1.1.2. Nguồn gốc: 2 1.1.3. Đặc điểm hình thái: 2 1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng: 3 1.1.5. Đặc điểm sinh lý: 3 1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto: 4 1.2. Alginate: 4 1.2.1. Cấu trúc của alginate: 4 1.2.2. Tính chất của alginate: 5 1.2.3. Ứng dụng của alginate: 7 1.3. Phương pháp cố định (bất động) tế bào: 7 1.3.1. Lịch sử phát triển: 7 1.3.2. Các phương pháp bất động tế bào: 9 1.3.3. Ứng dụng của phương pháp bất động tế bào: 12 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị: 14 2.1.1. Chủng vi sinh vật sử dụng: 14 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng: 14 2.1.3. Môi trường sử dụng: 14 2.1.4. Máy móc và dụng cụ: 15 2.2. Nội dung nghiên cứu: 16 2.2.1. Khảo sát thông số của quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate: 16 2.2.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt. 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu: 17 2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy chủng Bacillus subtilis natto: 17 2.3.2. Phương pháp làm sữa đậu nành: 18 2.3.3. Phương pháp cố định tế bào trong hạt Calci alginate: 18 2.3.4. Phương pháp phá hạt: 18 2.3.5. Phương pháp thử hoạt tính enzyme protease: 18 2.3.6. Phương pháp xác định số lượng tế bào: 19 2.3.7. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm: 20 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate: 22 3.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 25 3.2.1. Định tính enzyme protease có trong dịch nuôi cấy hạt alginate cố định B. subtilis natto: 25 3.2.2. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 Kết luận: 35 Kiến nghị: 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribo nucleic B. cereus Bacillus cereus B. subtilis natto Bacillus subtilis natto cfu Colony - forming units (Đơn vị khuẩn lạc hình thành) h Giờ L. acidophilus Lactobacillus acidophilus L. casei Lactobacillus casei L. delbrueckii Lactobacillus delbrueckii L. helveticus Lactobacillus helveticus L. plantarum Lactobacillus plantarum L. rhamnosus Lactobacillus rhamnosus NCBI National center for Biotechnology Information (Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học) s Độ lệch chuẩn S. cerevisiae Sacharomyces cerevisiae TB Trung bình VSV Vi sinh vật Z. mobilis Zymomonas mobilis DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 2.1. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14 2 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu 15 3 3.1. Số lượng tế bào cố định được trong hạt gel alginate và số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy ở điều kiện hiếu khí 23 4 3.2. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h 26 5 3.3. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt calci alginate 3% trong môi trường canh thang – sữa đậu nành tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h 27 6 3.4. Sơ bộ thử hoạt tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt calci alginate 3% trong môi trường sữa đậu nành tại 3 thời điểm 24h, 48h, 72h 28 7 3.5. So sánh đường kính vòng phân giải casein của enzyme protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau theo thời gian nuôi cấy hạt gel cố định B. subtilis natto 29 8 3.6. Số lượng tế bào B. subtilis natto cố định được trong 1 gam hạt gel alginate ban đầu và hạt gel lưu giữ trong 1 tháng 33 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ STT Tên hình Trang 1 1.1. Hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc của Bacillus subtilis natto 3 2 1.2. Cấu trúc không gian của acid (M) và acid (G) 5 3 1.3. Hình thể của block GGGG, MMMM, MGMG 5 4 1.4. Quá trình tạo gel của các phân tử calci alginate 6 5 1.5. Liên kết của ion Ca 2+ với alginate 7 6 1.6. Các phương pháp bất động tế bào cơ bản 11 7 3.1. Biến thiên đường kính vòng phân giải casein của enzyme protease trong dịch lên men của các môi trường khác nhau theo thời gian nuôi cấy hạt gel cố định B. subtilis natto 29 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bất động tế bào là một công nghệ mới và tiên tiến, dù ra đời chưa lâu nhưng nó đã thể hiện được nhiều ưu điểm vượt trội so với nhiều phương pháp sử dụng tế bào tự do và so với cả kỹ thuật bất động enzyme – cơ sở của phương pháp bất động tế bào. Sản xuất các chế phẩm sinh học bằng phương pháp bất động tế bào cho năng suất tạo sản phẩm cao hơn, sản phẩm tinh khiết hơn và đặc biệt có thể sản xuất liên tục trong một quá trình tự động hóa. Bất động tế bào đã thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và ngày càng có nhiều sản phẩm sinh học được sản xuất bằng phương pháp bất động tế bào ở quy mô công nghiệp. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto là một trong các vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulose… trong đó protease là enzyme được sản xuất và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Cố định tế bào B. subtilis natto có thể phát huy được các ưu điểm của phương pháp bất động tế bào hướng tới mục tiêu sản xuất enzyme protease. Vì vậy, khóa luận “Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào Bacillus subtilis natto được cố định trong gel alginate” được thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát thông số quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate. 2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt. [...]... lượng của hạt như: độ bền của hạt, khả năng sống sót của vi khuẩn… Số lượng tế bào được cố định trong các hạt calci alginate là một thông số quan trọng để đánh giá khả năng cố định tế bào của gel calci alginate Đồng thời từ đó có thể so sánh khả năng lên men của tế bào cố định và tế bào tự do Mục tiêu: - Xác định số lượng tế bào cố định được trong hạt gel alginate trước và sau 24h nuôi cấy - Xác định. .. 1010 tế bào và số lượng tế bào B subtilis natto trong 107 tế bào 3.2 Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trƣờng canh thang và chứa sữa đậu nành Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: 3.2.1 Định tính enzyme protease có trong dịch nuôi cấy hạt alginate cố định B subtilis natto: B subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài B subtilis Protease ngoại bào của loài B subtilis được. .. cấy số lượng tế bào vi khuẩn B subtilis natto có sự thay đổi: Số lượng tế bào cố định trong 1g hạt gel sau khi nuôi cấy 24h đạt giá trị 4,47 ban đầu là 4,11 1010 tế bào (giảm ít so với số lượng tế bào trong hạt gel 1011 tế bào) , chứng tỏ khả năng giữ tế bào của calci alginate 3% là tốt, đồng thời vi khuẩn B subtilis natto sau khi được cố định trong hạt gel calci alginate vẫn có khả năng sinh trưởng... kiện hiếu khí sau 24h + Xác định số lượng tế bào có trong dịch nuôi cấy khi nuôi cấy hạt gel ở điều kiện hiếu khí sau 24h 2.2.2 Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt + Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy các hạt gel alginate cố định B subtilis natto với môi trường canh thang... kiện hiếu khí Số lƣợng tế bào B subtilis natto Trong hạt gel alginate trước khi nuôi cấy Trong hạt alginate sau 24h nuôi cấy Trong dịch nuôi cấy hạt gel đã cố định tế bào sau 24h nuôi cấy s 1011 cfu/g 0,15 4,47 1010 cfu/g 0,21 107 cfu/ml 0,25 4,11 5,23 Nhận xét: Số lượng tế bào B subtilis natto cố định được trong 1g hạt gel alginate đạt giá trị 4,11 1011 tế bào Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh... khối lượng hạt gel cố định B subtilis natto trong môi trường canh thang ở 370C, tốc độ lắc 110 vòng/phút theo phương pháp nêu ở mục 2.3.1.c 23 Sau 24h, đếm số lượng tế bào trong 1g hạt gel cố định vi khuẩn đã nuôi cấy và số lượng tế bào trong 1ml dịch nuôi cấy thu được theo phương pháp nêu ở mục 2.3.5 Kết quả: Bảng 3.1 Số lượng tế bào cố định được trong hạt gel alginate và số lượng tế bào trong dịch nuôi... Kích thước tế bào vi khuẩn L acidophilus lớn hơn tế bào B subtilis natto nên cũng khó bị rơi ra ngoài môi trường hơn trong quá trình lắc bình lên men Kết luận sơ bộ: Số lượng tế bào B subtilis natto cố định được trong 1g hạt gel alginate 3% là 4,11 1011 tế bào Sau khi nuôi cấy trong môi trường canh thang (ở 370C, lắc 110 vòng/phút trong 24h), số lượng tế bào B subtilis natto trong 1g hạt gel đã giảm... natto với môi trường canh thang và môi trường chứa sữa đậu nành + Khảo sát sự tồn tại của enzyme protease trong dịch nuôi cấy hạt gel alginate cố định B subtilis natto ở các thời điểm khác nhau + Khảo sát khả năng tái sử dụng hạt: Xác định số lượng tế bào vi khuẩn B subtilis natto giữ lại được trong 1g hạt gel alginate 3% sau khi giữ trong môi trường canh thang ở tủ lạnh sau thời gian 1 tháng 17 2.3... Bình nón, cốc có mỏ, ống đong, cốc có chân, đĩa petri nhựa (đường kính 8,8cm), đĩa petri thủy tinh (đường kính 9cm), ống nghiệm, pipet bấm, đầu côn, ống li tâm, thước kẹp Palmer… 2.2 Nội dung nghiên cứu: Nội dung nghiên cứu giải quyết 2 mục tiêu sau: 2.2.1 Khảo sát thông số của quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate: + Xác định số lượng tế bào cố định được trong hạt gel trước... cứu của Nguyễn Thị Long với Lactobacillus acidophilus cho thấy 1g calci alginate 3% cố định được 24 108 – 7,03 3,57 108 tế bào [11]; nghiên cứu của Lê Thị Thu Hiền cũng cho thấy mật độ tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định trên gel calci alginate 3% khi cố định 100ml dịch nuôi cấy là 4,26 108 cfu/g [7] Mật độ này nhỏ hơn khoảng 1000 lần so với mật độ tế bào vi khuẩn B subtilis natto cố định . xuất enzyme protease. Vì vậy, khóa luận Khảo sát khả năng sinh protease của tế bào Bacillus subtilis natto được cố định trong gel alginate được thực hiện với 2 mục tiêu: 1. Khảo sát thông. cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate. 2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường canh thang và chứa sữa đậu nành. Khảo sát khả năng. cứu: 16 2.2.1. Khảo sát thông số của quá trình cố định tế bào Bacillus subtilis natto trong gel alginate: 16 2.2.2. Định tính enzyme protease trong dịch nuôi cấy tế bào cố định trong môi trường