Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Trong vài năm gần đây các dạng thuốc probiotics đang rất đƣợc quan tâm nghiên cứu và phát triển bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại cho sức khỏe của con ngƣời. Trong đó, Lactobacillus acidophilus là một trong những chủng vi sinh vật probiotics phổ biến nhất hiện nay bởi nhiều lợi ích mà nó mang lại. L. acidophilus xuất hiện từ rất sớm trong những thực phẩm truyền thống nhƣ sữa tƣơi, sữa chua, cũng nhƣ các sản phẩm bổ sung dinh dƣỡng23. Ở nƣớc ta, việc phát triển các sản phẩm probiotics đang trong giai đoạn đầu. Dạng bào chế probiotics thông dụng hiện nay là bột và cốm. Việc đảm bảo độ sống sót của vi sinh vật và bảo vệ vi sinh vật khi sử dụng qua đƣờng uống là vấn đề lớn còn mắc phải, do khi sử dụng theo đƣờng uống thuốc phải chịu tác động của các yếu tố nhƣ: pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật…23 là các yếu tố làm suy giảm số lƣợng sống sót của vi sinh vật đi rất nhiều. Trên thế giới, các nƣớc đã và đang tập trung nghiên cứu phát triển nhiều loại chế phẩm probiotics dạng pellet, bởi dạng pellet có nhiều ƣu điểm lớn nhƣ: rút ngắn thời gian lƣu thuốc ở dạ dày, ít bị rã ở dạ dày; mặt khác do pellet hình cầu, bề mặt nhẵn thuận tiện cho quá trình bao màng nhằm mục đích bảo vệ vi sinh vật, bao tan trong ruột…2, 3. Từ các lí do trên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hƣởng của tá dƣợc lên khả năng sống sót của Lactobacillus acidophilustrong pellet probiotic” nhằm 3 mục tiêu sau: 1. Khảo sát một số thông số trong quá trình tạo pellet probiotics chứa Lactobacillus acidophilustừ nguyên liệu đông khô tự tạo. 2. Đánh giá ảnh hƣởng của một số giai đoạn trong quá trình tạo pellet đến sự sống sót của vi sinh vật và theo dõi độ ổn định của pellet probiotics. 3. Khảo sát ảnh hƣởng của tỉ lệ dƣợc chất và tá dƣợc lactose đến số lƣợng vi sinh vật trong pellet thu đƣợc.
BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CAO HÀ PHƢƠNG KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CALCI CLORID VÀ THỜI GIAN TẠO HẠT LÊN QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CAO HÀ PHƢƠNG KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CALCI CLORID VÀ THỜI GIAN TẠO HẠT LÊN QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH TẾ BÀO NẤM MEN Saccharomyces cerevisiae KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: ThS Kiều Thị Hồng Nơi thực hiện: BM Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Với kính trọng lịng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo ThS Kiều Thị Hồng – Giảng viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội cô giáo TS Đàm Thanh Xuân, thầy giáo DS Lê Ngọc Khánh, người thầy quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu mơn, để tơi hồn thành đề tài Đồng thời, xin cảm ơn thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho q trình thực khóa luận Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến tồn thể thầy giáo trường dạy dỗ, dìu dắt tơi suốt năm học trường Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Hà Nội, tháng năm 2014 Sinh viên Cao Hà Phương MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ ………………………………………………………………… …1 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN ………………………………………………….….2 1.1 Phƣơng pháp cố định (bất động) tế bào ………………………………… 1.1.1 Phương pháp cố định tế bào ………………………………………….….2 1.1.1.1 Phân loại…………………………………………………………….….2 1.1.1.2 Ưu nhược điểm ……………………………………………………… 1.1.1.3 Ứng dụng …………………………………………………………… 1.1.2 Alginat ………………………………………………………………… 1.1.2.1 Nguồn gốc…………………………………………………………… 1.1.2.2 Cấu tạo, tính chất…………………………………………………….…6 1.1.2.3 Ứng dụng…………………………………………………………….…9 1.2 Nấm men Saccaromyces cerevisiae……………………………………… 10 1.2.1 Phân loại khoa học ……………………………………………………….10 1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo ………………………………………………11 1.2.3 Đặc điểm sinh lý ………………………………………………………….11 1.2.4 Ứng dụng …………………………………………………………………13 CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… 15 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị …………………………………………………… 15 2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất …………………………………………………….15 2.1.2 Vi sinh vật sử dụng ……………………………………………………….15 2.1.3 Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm men …………………………………15 2.1.4 Dụng cụ, thiết bị ………………………………………………………….16 2.2 Nội dung nghiên cứu ……………………………………………………… 17 2.2.1 Khảo sát số thơng số ảnh hưởng đến q trình tạo hạt….………… 17 2.2.2 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào hạt.……….17 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ………………………………………………….17 2.3.1 Phương pháp giữ giống môi trường thạch nghiêng……….….…….17 2.3.2 Phương pháp cấy nhân giống từ môi trường thạch nghiêng…….…… 17 2.3.3 Phương pháp xác định sinh khối mẫu nuôi cấy ………….…… 18 2.3.4 Phương pháp đồng alginat với sinh khối………………………….18 2.3.5 Phương pháp tạo hạt bất động tế bào……………………………….… 18 2.3.6 Phương pháp ni cấy hiếu khí hạt chứa sinh khối…………………….19 2.3.7 Phương pháp phá hạt……………………………………………………19 2.3.8 Phương pháp đo kích thước hạt…………………………….… 19 CHƢƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………….20 3.1 Khảo sát thông số ảnh hƣởng đến trình tạo hạt ……….…….…20 3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ calci clorid đến kích thước hạt…… 20 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm calci clorid lên hình thành hạt……………………………………………………………………22 3.1.3 Khảo sát lượng sinh khối tối đa cố định được……………………… ….27 3.2 Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào hạt………30 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm hạt dung dịch calci clorid lên khả giữ tế bào nấm men hạt cố định ni cấy hiếu khí…………………………………………………………….… 30 3.2.2 Khảo sát mối liên quan kích thước hạt số lượng tế bào cố định trình tạo hạt……………………………………………… 33 3.2.3 Khảo sát mối liên quan kích thước hạt số lượng tế bào cố định q trình ni cấy hiếu khí…………………………………… 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ………………………………………………… 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Nguồn gốc nguyên liệu, hóa chất 15 Bảng 3.1 Sự thay đổi đường kính hạt gel alginat theo kích thước đầu 20 kim nồng độ dung dịch calci clorid Bảng 3.2 Sự thay đổi đường hạt bề dày lớp vỏ hạt tạo thành theo 23 thời gian Bảng 3.3 Lượng sinh khối giữ sau tạo hạt 28 Bảng 3.4 Lượng sinh khối bình ni cấy hiếu khí sau 24h 31 chứa hạt với thời gian ngâm calci clorid phút phút Bảng 3.5 Biến thiên lượng sinh khối 10g hạt theo kích thước 33 hạt Bảng 3.6 Lượng sinh khối bình ni cấy hiếu khí sau chứa 35 hạt khác kích thước sau 24h Bảng 3.7 Lượng sinh khối ban đầu dùng để trộn lượng sinh khối sau nuôi cấy hạt bình điều kiện hiếu khí 36 DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ Tên hình ảnh, đồ thị Trang Hình 1.1 Cấu trúc natri alginat Hình 1.2 ion Ca2+ kết hợp với sợi alginat tạo thành mạng lưới Hình 3.1 Hạt bị cắt sau khoảng thời gian ngâm khác (hạt to) 23 calci clorid 2% Hình 3.2 Hình ảnh hạt tạo thay đổi theo thời gian (hạt to) ngâm 25 calci clorid 2% Hình 3.3 Hạt bị kéo 28 Hình 3.4 Sắp xếp tế bào nấm men cấu trúc hạt alginat cố định 29 kính hiển vi Đồ thị 3.1 Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt 24 cố định theo thời gian loại hạt nhỡ Đồ thị 3.2 Thay đổi tỉ lệ bề dày lớp vỏ hạt tạo thành so với kích thước hạt cố định theo thời gian loại hạt to 24 ĐẶT VẤN ĐỀ Cố định tế bào công nghệ tiên tiến, dù đời chưa lâu thể ưu điểm vượt trội so với kĩ thuật truyền thống sử dụng tế bào tự với kĩ thuật bất động enzym nghiên cứu sâu từ trước Sản xuất chế phẩm sinh học cố định tế bào đơn giản hơn, cho suất tạo sản phẩm cao đặc biệt sản xuất liên tục qui trình tự động hóa Ngày có nhiều sản phẩm sinh học sản xuất phương pháp bất động tế bào qui mô công nghiệp như: sản xuất siro fructose từ tinh bột, sản xuất 6APA tiền chất để tổng hợp nhiều kháng sinh nhóm β – lactam, sản xuất ethanol dùng nhiều ngành cơng nghiệp lượng… Trong alginat chất mang hay dùng cố định tế bào Nhằm mục đích nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định tế bào sử dụng alginat, tiến hành nghiên cứu tế bào vi sinh vật nấm men với khóa luận: “Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ CaCl2 thời gian tạo hạt lên trình cố định tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae” Với mục tiêu: Khảo sát thơng số ảnh hưởng đến q trình tạo hạt Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào hạt CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Phƣơng pháp cố định (bất động) tế bào: 1.1.1 Phƣơng pháp cố định tế bào: Năm 1916, Nelson Griffin tình cờ nhận thấy enzym invertase nấm men hấp phụ than hoạt giữ nguyên hoạt tính cho phản ứng thủy phân đường mía Đây phát bất động enzym, sau có nhiều nghiên cứu báo cáo bất động enzym giới Phương pháp cố định tế bào ngày bắt nguồn từ phương pháp cố định enzym Nguyên lý phương pháp cố định enzym mơ tả sau: Enzym dạng tinh khiết gắn gói vào polymer khơng hịa tan nước Các hạt enzym nhồi vào cột hình trụ có kích thước thích hợp, sau cho dung dịch chất chảy qua, enzym thực phản ứng phân cắt tạo sản phẩm tương ứng 1.1.1.1 Phân loại: Có chia phương pháp cố định tế bào làm loại: liên kết với chất mang, liên kết ngang, bẫy kết hợp phương pháp o Phương pháp liên kết với chất mang: Bản chất phương pháp liên kết chất xúc tác sinh học (tế bào, enzym…) với chất mang không tan nước thơng qua liên kết đồng hóa trị, liên kết ion, hấp phụ vật lý liên kết sinh học đặc biệt Đặc tính vật liệu làm chất mang: độ cứng học, vật lý, hóa học, độ ổn định sinh học không độc Thường dùng polysaccharide không tan nước (cellulose, dextran, dẫn xuất agarose…), protein (gelatin, albumin…), polymer nhân tạo (polystyrene, nhựa trao đổi ion, polyerethan…), vật liệu vô (thủy tinh, ceramic…) Phương pháp đồng hóa trị sử dụng thường xuyên để bất động enzym, dùng cho bất động tế bào tác nhân cần có hình thành liên kết đồng hóa trị thường chất độc với tế bào [15],[17],[24] o Phương pháp tạo liên kết ngang: Tác nhân tạo liên kết ngang glutaraldehyd, diisocyanat… glutaraldehyd tác nhân phổ biến Các nhóm amino glutaraldehyd tạo thành liên kết ngang với tế bào Các tác nhân nhóm diisocyanat (toluene diisocyanat…) tạo liên kết ngang cách liên kết nhóm urea với nhóm amoni Enzym aspetase E coli Bacillus coagulans bất động phương pháp [22] o Phương pháp bẫy: Dựa theo tính chất vật liệu để bẫy tế bào chia làm loại: dạng lưới, dạng nang nhỏ (microcapsule), dạng liposome dạng màng Ở dạng lưới bẫy, chất xúc tác sinh học bẫy khuôn gel nhiều loại polymer khác Ở dạng microcapsule, tế bào gói màng polymer thẩm thấu nhân tạo thành nang nhỏ Ở dạng liposom, tế bào bẫy màng chất lỏng tạo thành từ hợp chất amphiphatic Còn dạng màng, chất xúc tác sinh học tách riêng khỏi môi trường màng siêu lọc, màng lọc sợi rỗng [14] Nguồn nguyên liệu tự nhiên để bất động tế bào thường sử dụng polysaccharide như: alginat, k-carageenan, agar…, alginat sử dụng phổ biến [15],[30] Một số nghiên cứu gần gel Calci-pectat lựa chọn cho bất động tế bào [30] 1.1.1.2 Ƣu nhƣợc điểm: Phương pháp sử dụng nghiên cứu phương pháp bẫy với chất mang alginat có ưu nhược điểm sau: ■ - Ưu nhược điểm phương pháp: Ưu điểm: Đảm bảo cho trình sản xuất liên tục Có thể ngừng nhanh q trình phản ứng cách tách hệ chất mang chứa tế bào khỏi chất Mật độ tế bào đơn vị thể tích hệ cao nên dùng thiết bị phản ứng nhỏ hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn, hấp thu chất tăng cải thiện 28 Kết quả: Bảng 3.3: Lượng sinh khối giữ sau tạo hạt Lượng sinh Lượng Lượng sinh Ghi (tỉ lệ sinh khối sau ly khối trộn alginat 2% khối sau ly tâm tâm so với lượng trước trộn) 5,50g 5,47g 99,45% 9,00g 8,36g 92,89% 22,51g 90,04% (hạt bị kéo đuôi) 25,00g 10ml Không tạo giọt >25,0g 2g sinh 10ml Không tạo giọt khối khô 15ml Không tách rõ ràng thành hạt 20ml 6,25g Hạt bị kéo đuôi nhiều Hình3.3: Hạt bị kéo 29 Hình 3.4: Sắp xếp tế bào nấm men cấu trúc hạt alginat kính hiển vi Nhận xét bàn luận: Khi trộn lượng sinh khối khô (2g) với thể tích alginat 2% khác để thu hỗn hợp với tỉ lệ sinh khối cao hạt khó tạo thành: 2g sinh khối khơ/10ml alginat 2% khơng tạo giọt được; 2g sinh khối khơ/15ml alginat không tách thành giọt mà thành đoạn alginat; 2g sinh khối khô/20ml alginat tạo hạt hạt bị kéo đuôi Khi dùng sinh khối ướt trộn với 10ml alginat 2% để thu hỗn hợp với tỉ lệ sinh khối cao 2,5g/ml kg alginat 2% tạo hạt bị kéo đuôi; tăng tỉ lệ lên > 2,5g/ml khơng tạo giọt Điều giải thích sau: Khi tỉ lệ sinh khối nấm men đem trộn với alginat cao làm loãng đáng kể nồng độ alginat, nồng độ alginat thấp 2% khơng tạo hạt hình cầu mà tạo hạt có đi, khơng đảm bảo cho cố định tế bào hệ gel, tới nồng độ alginat giảm tới 1% trở xuống khơng tạo hạt [12] Khi tăng tỉ lệ sinh khối so với thể tích natri alginat để tạo hạt: với lượng trộn tỉ lệ 0,55g sinh khối/1ml alginat 2% hạt cố định 99,45% lượng tế bào ban đầu; tăng tỉ lệ trộn lên 0,9 g sinh khối ướt/ml ta có lượng tế bào giữ 30 hạt gel alginat 92,89%; tiếp tục tăng đến 2,5g/ml lượng giữ 90,04% sinh khối đem trộn hạt tạo thành bị kéo đuôi; đến tăng tới 3,0g/ml khơng tạo hạt Khi lượng sinh khối chưa đạt đến mức tối đa mà gel alginat giữ tỉ lệ sinh khối sau phá hạt ly tâm so với lượng sinh khối đem trộn đạt 90% Có thể kết luận lượng sinh khối ướt tối đa cố định 1ml alginat 2% 2,5g Do tăng tỉ lệ sinh khối ướt lên 2,5g/ml alginat 2% nồng độ alginat dịch trộn với sinh khối thấp, không đủ để tạo thành hạt 3.2 Khảo sát số yếu tố ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào hạt: 3.2.1 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian ngâm dung dịch CaCl2 đến khả giữ tế bào nấm men hạt cố định nuôi cấy hiếu khí: Mục đích: So sánh khả giữ tế bào nấm nen hạt cố định nuôi cấy hiếu khí thay đổi thời gian ngâm hạt calci clorid 2% Tiến hành: - Ly tâm dịch nuôi cấy theo phương pháp mục 2.3.3 - Cân lấy 0,4g sinh khối vừa ly tâm trộn với 40ml dung dịch natri alginat 2% mục 2.3.4 - Dùng kim 16G lấy 5ml hỗn hợp vừa trộn để tạo hạt với khoảng 30ml CaCl2 2% (theo phương pháp mục 2.3.5), ngâm cốc riêng biệt phút phút - Vớt hạt, rửa hạt dung dịch NaCl 0,9% tủ cấy vô trùng, cho loại hạt vào bình nón 50ml mơi trường, ni cấy hiếu khí theo mục 2.3.6 - Sau 24h, lọc hạt vợt hạt để tách riêng hạt dịch nuôi cấy: Ly tâm dịch nuôi cấy, cân lại lượng sinh khối loại Phá hạt (ở mục 2.3.7), ly tâm dịch phá hạt, cân lại lượng sinh khối loại 31 Kết quả: Theo cách tiến hành, ta có lượng sinh khối ban đầu (trước ni cấy hiếu khí) 5ml hạt 0,05g Bảng 3.4: Lượng sinh khối bình ni cấy hiếu khí sau 24h chứa hạt với thời gian ngâm calci clorid phút phút Ngày Lượng sinh khối (g) Thời gian ngâm hạt Tỉ lệ sinh khối (%) Dịch Hạt Tổng Dịch Hạt phút 0,23 1,26 1,49 15,44 84,56 phút 0,28 1,27 1,55 18,06 81,94 phút 0,36 1,69 2,05 17,56 82,44 phút 0,41 1,38 1,79 22,91 77,09 phút 0,19 1,20 1,39 13,67 86,33 phút 0,24 1,18 1,42 16,90 83,10 phút 0,40 1,34 1,74 22,99 77,01 phút 0,66 1,68 2,34 28,21 71,79 Trung phút 0,295 1,373 1,668 16,81 83,19 bình phút 0,398 1,378 1,775 21,48 79,02 20/2 24/2 10/3 17/4 Nhận xét bàn luận: So sánh lượng sinh khối bình nhiều so trước sau ni cấy hiếu khí ta nhận thấy lượng tế bào sau nuôi cấy tăng lên với lượng tế bào ban đầu: ban đầu bình có 0,05g sinh khối hạt, sau 24h ni cấy có 1,6 – 1,7g sinh khối tồn bình Do q trình ni cấy hạt cố định tế bào tế bào nấm men tiếp tục phát triển 32 Sau ni cấy hiếu khí, tổng lượng sinh khối bình chứa hạt cố định chứa tế bào nấm men ngâm calci clorid phút phút (1,6 – 1,7g) Trong bình ni cấy hiếu khí chứa hạt cố định tế bào nấm men với thời gian ngâm calci clorid 2% phút phút tốc độ phát triển tế bào nấm men tương tự Sau 24h ni cấy hiếu khí, hạt cố định giữ phần lớn tế bào nấm men: lượng sinh khối nấm men thu sau phá hạt ly tâm dịch phá hạt tất mẻ chiếm 70% so với tổng lượng sinh khối bình ni cấy Do lượng tế bào nấm men chứa loại hạt sau nuôi cấy chưa đạt lượng tối đa mà gel alginat giữ (2,5g sinh khối /ml alginat theo kết khảo sát mục 3.1.3) nên phần lớn tế bào sinh thêm q trình ni cấy khơng bị ngồi hạt cố định Lượng tế bào thất thoát vào dịch mơi trường q trình ni cấy hiếu khí loại hạt cố định với thời gian ngâm calci clorid phút phút nằm khoảng 13 – 28% (theo số liệu bảng 3.4) Tế bào thất thoát từ hạt dịch mơi trường ni cấy q trình lắc làm tế bào bề mặt hạt không giữ tế bào bên hệ gel alginat nên tế bào bề mặt hạt bị rơi ngồi, sau rơi ngồi tế bào tiếp tục phát triển dịch môi trường Sau hạt ngâm phút hạt phần rỗng bên ruột nhiều so với hạt ngâm phút, lấy hạt khỏi dung dịch calci clorid rửa hạt loại hạt tiếp tục rắn lại bên nên hạt gel alginat chứa tế bào ngâm phút calci clorid 2% có khả giữ tế bào tương tự hạt cố định ngâm phút dung dịch 2% calci clorid ► Kết luận: Trong q trình ni cấy hiếu khí hạt cố định tế bào, khơng có khác biệt đáng kể thơng số tổng lượng sinh khối bình, lượng sinh khối dịch ni cấy lượng sinh khối giữ hạt cố định loại hạt tạo với thời gian ngâm khác calci clorid 2% phút phút 33 3.2.2 Khảo sát mối liên quan kích thƣớc hạt với số lƣợng tế bào cố định trình tạo hạt: Mục đích: So sánh khả giữ tế bào nấm men alginat thay đổi kích thước hạt cố định Tiến hành: Nuôi cấy nấm men theo phương pháp mục 2.3.1 3.3.2 Ly tâm dịch nuôi cấy (như mục 2.3.3) Cân lấy 5g sinh khối trộn với 80ml dung dịch natri alginat 2% (phương pháp mục 2.3.4) Dùng pipet, kim 16G, kim 26G lấy 15ml hỗn hợp alginat – sinh khối để tạo hạt với calci clorid 2% (phương pháp mục 2.3.5) Ngâm hạt dung dịch calci clorid phút Rửa hạt nước cất, cân 10,0g hạt loại Phá hạt (như mục 2.3.7) Ly tâm dịch phá hạt (theo mục 2.3.3) Cân lượng sinh khối loại Kết quả: Bảng 3.5: Biến thiên lượng sinh khối 10g hạt theo kích thước hạt Sinh khối sau ly tâm Ngày Hạt nhỏ Hạt nhỡ Hạt to 16/10 1,0995 1,0998 1,0267 17/10 0,9742 0,9619 0,9541 18/10 0,9447 1,0356 1,0607 23/10 1,2181 1,1600 1,1149 Trung bình 1,0874 1,0985 1,0674 Nhận xét bàn luận: Kích thước hạt khơng ảnh hưởng đến số lượng sinh khối giữ được, kích thước lượng sinh khối giữ đạt khoảng 1,06 – 1,10 g sinh khối/ 10g hạt Điều giải thích sau: 34 Do lượng sinh khối sử dụng để trộn với alginat 2% chưa đạt đến lượng tối đa mà gel alginat giữ phần lớn sinh khối giữ lại (trên 90% theo thí nghiệm 3.1.3) nên lượng sinh khối kích thước hạt giữ sau q trình tạo hạt 3.2.3 Khảo sát mối liên quan kích thƣớc hạt với số lƣợng tế bào cố định đƣợc q trình ni cấy hiếu khí: Mục đích: So sánh khả giữ tế bào nấm men alginat ni cấy hiếu khí hạt cố định có kích thước khác Tiến hành: - Ly tâm dịch nuôi cấy theo phương pháp mục 2.3.3 - Cân lấy 0,4g sinh khối vừa ly tâm trộn với 40ml dung dịch natri alginat 2% mục 2.3.4 - Dùng pipet, kim 16G, kim 26G, loại lấy 5ml hỗn hợp vừa trộn để tạo hạt với khoảng 30ml CaCl2 2% (theo mục 2.3.5), ngâm cốc riêng biệt phút - Vớt hạt, rửa hạt dung dịch NaCl 0,9% tủ cấy vô trùng, cho hạt vào bình nón 100ml mơi trường, ni cấy hiếu khí theo phương pháp mục 2.3.6 - Sau 24h, lọc hạt vợt hạt để tách riêng hạt dịch nuôi cấy: Ly tâm dịch nuôi cấy, cân lại lượng sinh khối loại Phá hạt (như mục 2.3.7), ly tâm dịch phá hạt, cân lại lượng sinh khối loại 35 Kết quả: Bảng 3.6: Lượng sinh khối bình ni cấy hiếu khí chứa hạt khác kích thước sau 24h Lượng sinh khối Ngày Tỉ lệ sinh khối so với tổng lượng bình (%) Loại hạt Dịch 2,28 2,79 18,28 81,72 0,69 2,23 2,92 23,63 76,37 0,80 2,04 2,84 28,17 71,83 Hạt nhỏ 0,63 2,35 2,98 21,14 78,86 0,86 2,22 3,08 27,92 72,08 1,00 2,00 3,00 33,33 66,67 Hạt nhỏ 0,52 2,54 3,06 16,99 83,01 0,60 2,48 3,08 19,48 80,52 Hạt to 0,83 2,52 3,35 24,77 75,22 Hạt nhỏ 0,91 2,91 3,82 23,82 76,18 Hạt nhỡ 1,00 2,65 3,65 27,40 72,60 Hạt to bình 0,51 Hạt nhỡ Trung Hạt nhỏ Hạt to 17/4 Hạt Hạt nhỡ 15/4 Dịch Hạt to 24/2 Tổng Hạt nhỡ 17/1 Hạt 1,40 2,14 3,54 30,55 69,45 Hạt nhỏ 0,643 2,520 3,163 20,06 79,94 Hạt nhỡ 0,788 2,395 3,183 24,61 75,39 Hạt to 1,008 2,175 3,183 29,21 70,79 36 Từ cách tiến hành Bảng 3.6 ta thu kết sau: Bảng 3.7: Lượng sinh khối ban đầu dùng để trộn lượng sinh khối sau nuôi cấy hạt bình điều kiện hiếu khí Lượng sinh khối (g) Hạt nhỏ Hạt nhỡ Ban đầu (lượng dùng để trộn) Hạt to 0,05 Trong dịch Sau tạo 0,643 0,788 1,008 Trong hạt 2,520 2,395 2,175 Tổng 3,163 3,183 3,183 hạt Nhận xét bàn luận: So sánh lượng sinh khối bình trước sau ni cấy hiếu khí ta nhận thấy lượng tế bào sau nuôi cấy tăng lên nhiều so với lượng tế bào ban đầu: ban đầu bình có 0,05g sinh khối hạt, sau 24h ni cấy có sinh khối tồn bình khoảng 3,163 – 3,183g Do trình ni cấy hạt cố định tế bào tế bào nấm men tiếp tục phát triển Tổng lượng sinh khối bình với kích thước hạt cố định chứa tế bào nấm men sau ni cấy hiếu khí nhau: khoảng 3,163 – 3,183g Trong bình ni cấy chứa hạt cố định có kích thước khác tế bào nấm men có tốc độ phát triển tương tự Lượng tế bào thất thoát từ hạt cố định vào dịch mơi trường q trình ni cấy hiếu khí nằm khoảng 16 – 33% (theo số liệu bảng 3.6) Tế bào thất thoát từ hạt dịch mơi trường ni cấy giải thích trình lắc làm tế bào bề mặt hạt không giữ tế bào 37 bên hệ gel alginat nên tế bào bề mặt hạt bị rơi ngoài, sau rơi ngồi tế bào tiếp tục phát triển dịch môi trường Sau 24h nuôi cấy hiếu khí, phần lớn sinh khối (trong khoảng 70 – 80%) giữ hạt cố định loại kích thước: trung bình lượng sinh khối hạt nhỏ chiếm 79,94% tổng lượng sinh khối bình, với hạt nhỡ 75,39% hạt to 70,79% Do lượng tế bào nấm men chứa loại hạt sau nuôi cấy chưa đạt lượng tối đa mà gel alginat giữ (2,5g sinh khối/ml alginat theo kết khảo sát mục 3.1.3) nên phần lớn tế bào sinh thêm q trình ni cấy khơng bị ngồi hạt cố định ► Kết luận: q trình ni cấy hiếu khí hạt cố định tế bào, khơng có khác biệt đáng kể thông số: tổng lượng sinh khối bình, lượng sinh khối dịch nuôi cấy lượng sinh khối giữ hạt cố định kích thước hạt cố định khác 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận: Từ kết khảo sát trên, đề tài đưa số kết luận sau: Đã tiến hành khảo sát số thông số ảnh hưởng đến trình tạo hạt, thu kết sau: Kích thước dụng cụ tạo hạt (kích thước đầu nhỏ giọt) qui định kích thước hạt: với kim số 26G tạo hạt với đường kính 2,4mm; với kim 16G hạt tạo có đường kính 3,9mm; tạo hạt với pipet 5ml cho hạt có đường kính 4,4mm Nồng độ dung dịch calci clorid dùng để tạo hạt khơng ảnh hưởng đến kích thước hạt tạo thành Khi hạt chưa đạt thời gian rắn, hạt tạo lớp vỏ đặc dần vào Thời gian rắn hạt hạt to 14 phút, hạt nhỡ có thời gian rắn hạt 10 phút thời gian rắn hạt nhỏ phút Lượng sinh khối ướt tối đa cố định 1ml alginat 2% 2,5g Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến số lượng tế bào hạt: Trong q trình ni cấy hiếu khí, tế bào nấm men hạt cố định phát triển Sau 24h nuôi cấy hiếu khí, hạt cố đinh ngâm calci clorid 2% với thời gian phút phút giữ lượng sinh khối 70% tổng lượng sinh khối bình Trong trình tạo hạt, với kích thước (hạt nhỏ, hạt nhỡ, hạt to) lượng sinh khối giữ đạt khoảng 1,06 – 1,10g sinh khối/10g hạt Sau 24h nuôi cấy hiếu khí, hạt cố định với kích thước khác (hạt nhỏ, hạt nhỡ, hạt to) giữ lượng sinh khối khoảng 70 – 80% so với tổng lượng sinh khối bình 39 Đề xuất: Vì thời gian thiết bị hạn chế nên chưa nghiên cứu hết vấn đề xung quanh trình cố định tế bào, đưa số đề xuất: o Khảo sát ảnh hưởng nồng độ alginat lên trình cố định tế bào nấm men o Khảo sát ảnh hưởng nồng độ calci clorid thời gian tạo hạt cố định chủng vi sinh vật khác: Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus… TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình, Phan Văn Chi (2003), Áp dụng kỹ thuật phân tử nghiên cứu tài nguyên vi sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr.135-151 Đỗ Quốc Cường (2009), Nâng cao chất lượng sữa chua phương pháp vi gói vi khuẩn lactic, Trường Đại học kỹ thuật công nghiệp TP.HCM Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội (2009), Giáo trình thực tập sản xuất thuốc Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm văn Ty (2002), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr.84-87 Nguyễn Lân Dũng cộng (2002), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, tr.11,87 Từ Minh Koóng, Đàm Thanh Xuân (2007), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm, NXB y học, Hà Nội Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzym, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh, tr.453 Trần Thị Ngọc Mai (2007), Nghiên cứu khả bất động tế bào nấm men Saccaromyces cerevisiae gel Calci – alginat, Trường Đại học Dược Hà Nội Ngô Đăng Nghĩa (1999), “Tối ưu hóa quy trình cơng nghệ sản xuất alginat natri từ rong mơ Việt Nam ứng dụng sản xuất rượu vang” Luận văn thạc sĩ, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội 10 Lương Đức Phẩm (2009), Nấm men công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội, tr5, 32-40, 69, 50, 103, 300 11 Lương Đức Phẩm (2000), Vi sinh vật học an tồn vệ sinh thực phẩm, NXB Nơng nghiệp, tr 35-38, 75-80 12 Chuhhum Sokheng (2011), Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginat kích thước vi sinh vật lên trình cố định tế bào, Trường Đại học Dược Hà Nội 13 Lê Ngọc Tú (2002), Hóa sinh cơng nghiệp, NXB Giáo dục, tr.15 14 Nguyễn Văn Việt (2001), Nấm men bia ứng dụng, NXB Nông nghiệp, tr.38,43 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 15 Atsuo Tanaka and Takuo Kawamoto, Cell immobilization, Kyoto university Kyoto, Japan, pp 505-512 16 Coates D, Richardson G (1974), “A note on the production of sterile solutions of sodium alginat” Can J Pharm Sci, 9: 60-61 17 Dara L Fileming (2004), Evaluating bacterial cell immobilization matrice for use in a biosensor, pp 9-10 18 D Poncelet (2001), Production of alginate beads by emulsification/internal gelation, Annals of the New York Academy of Sciences (Impact Factor: 4.38); 944:74-82 19 Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando (2009), “Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions”, Journal of Functional Food, 319-323 20 Hartman AW et al (1975) “Viscosites of acacia and sodium alginat aftersterilization by cobalt-60” J Pharm Sci; 64: 802-805 21 James L Schreve, Jinnie M Garett (2003), Yeast Agp2p and Agp3p function as amino acid permeases in poor nutrient conditions, Department of Biology, Hamilton College, Clinton, NY13323, USA Received 18 November, p.2-43 22 Jiyeon Ha (2005), Bioremediation of organophosphate pesticide, coumaphos, using microorganisms immobilized in calcium – alginat gel beads, pp 22-29 23 Latha Sabikhi, R Dabu, D.K Thompkinson Suman Kapila (2008), “Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions”, Food Bioprocess Technol (2010) 3, pp586-593 24 Pramod Kumar Singh, Parneet Kaur Deol and Indu Pal Kaur (2011), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginat beads for effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 2012, 3, 83-90 25 Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn (2009), The Handbook of Pharmaceutical Excipients, Pharmaceutical Press (Handbook) 26 Shinji Sugiura, Tatsuya Oda, Yasuhiko Izumida, Yasuyuki Aoyagi, Mitsuo Satake, Atsushi Ochiai, Nobuhiro Ohkohchi, Mitsutoshi Nakajima (2004),”Size control of calcium alginat beads containing living cells using micro-nozzle array”, Biomaterials, Volume 26, Issue 16, Pages 3327-3331 27 SV Ramakrishna and Prakasham, “Microbial fermentation with immobilized cells”, Biochemical and Environmental Engineering, Indian Instisute of Chemical Technology, Hyderabad 500 007, India 28 T I Klokk and J E Melvik (2002), “Controlling the size of alginat gel beads by use of a high electrostatic potential”, J.Microencapsul; 19(4):415-24 29 Vandenbossche GMR, Remon J-P., “Influence of the sterilization process on alginat dispersions”.J Pharm Pharmacol 1993; 45: 484-486 30 www.ias.ac.in/currsci/jul10/articles17.htm 31 http://www.rsc.org/learn-chemistry/resources/chemistry-in-yourcupboard/gaviscon/3 ... nồng độ calci clorid tăng dần (từ 2% đến 6%) thời gian rắn hạt giảm dần: với hạt nhỡ, nồng độ calci clorid 2% hạt rắn lại sau 10 phút, nồng độ calci clorid 4% thời gian phút 6% calci clorid sau... hạt to, dùng nồng độ calci clorid 2% hạt thu rắn lại sau 14 phút, 4% calci clorid thời gian rắn hạt 12 phút 6% calci clorid thời gian rắn hạt giảm phút Do tăng nồng độ calci clorid, lượng ion... khoảng thời gian ngâm khác (hạt to) 23 calci clorid 2% Hình 3.2 Hình ảnh hạt tạo thay đổi theo thời gian (hạt to) ngâm 25 calci clorid 2% Hình 3.3 Hạt bị kéo 28 Hình 3.4 Sắp xếp tế bào nấm men cấu