Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐÈ Acid ascorbic (vitamin C) là một chất có nhiều trong trái cây và là chất rất cần thiết cho sự sống của sinh vật. ở lĩnh VỊĨC hóa sinh, nó là chất chống oxy hóa, tliain gia vào các quá trìnli tổng hợp enzym, tăng sức đề kliáng, phục hồi sức kliỏe, đặc biệt ngăn ngìra bệnli scorbut ở Iigirời. Acid ascorbic còn được dùng làm chất bảo quản tlụrc phẩm và làm hương vị cho một số loại nước uống. Với nliiềii vai trò quan trọng cùng với sự có mặt của vitamin c từ trái cây cho đến nước uống, từ viên thuốc cho đến kẹo ngậm, có thể nói vitamin c là một thuốc sử dimg rất phổ biến trên thực tế. Cimg cấp đều đặn vitamin c cho cơ thể có ý nghĩa lớn để góp phần duy trì và nâng cao sức Idiỏe cho con ngirời. Là vitamin dễ tan trong nước, có thời gian bán thải nhanh, do đó khi sử dimg vitamin c trong điều trị, người bệnh phải dùng thuốc nhiều lần trong ngày, gây khó khăn trong việc sử dụng thuốc, giảm hiệu quả điều trị. Vì vậy việc nghiên cứu phát triển dạng thuốc viên tác dụng kéo dài của vitamin c có ý nghĩa lớn về thực tế. Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài; ‘‘Nghiên cứu bào chế viên nén vitamin c tác dụng kéo dài bằng phương pháp dập thẳng vói tá dược HPMC” với các mục tiêu sau: ỉ. Nghiên cứu bào chế viên vitamin c tác dụng kéo dài với tá dược HPMC 4K và HPMC lOOK. 2. Khảo sát yểu tổ về thành phần trong công thức bào chế ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất của viên vitamin c từ viên. 3. Khảo sát yếu tổ về kĩ thuật bào chế ảnh hưởng đến khả năng giải phóng dược chất.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ XUÂN CƯỜNG BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7 TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ XUÂN CƯỜNG BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7 TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Lê Ngọc Khánh Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo DS. Lê Ngọc Khánh – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Lê Xuân Cường MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto 3 1.1.1. Giới thiệu 3 1.1.2. Phân loại khoa học 3 1.1.3. Nguồn gốc 3 1.1.4. Đặc điểm hình thái 4 1.1.5. Đặc điểm sinh lý 4 1.1.6. Đặc điểm sinh dưỡng 4 1.2. MK-7 - sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto 5 1.2.1. Nguồn gốc 5 1.2.2. Cấu trúc 6 1.2.3. Tính chất 6 1.3. Cơ chế tác dụng của MK-7. 7 1.3.1. MK-7 với sức khỏe của xương. 7 1.3.2. MK-7 với sức khỏe tim mạch. 8 1.4. Công dụng 9 1.5. Lên men tạo MK-7 từ Bacillus subtilis natto 10 1.5.1. Nuôi cấy vi sinh vật sản xuất MK – 7. 10 1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp, chiết tách các chất từ dịch lên men của Bacillus subtilis natto. 11 1.6. Một số nghiên cứu về B. subtilis natto và MK-7 13 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 15 2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 15 2.1.3. Môi trường 15 2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. 16 2.2.2. Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. 17 2.3.2. Phương pháp chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy 18 2.3.3. Phương pháp định tính MK-7 bằng sắc kí lớp mỏng 19 CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22 3.1. Khảo sát có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.22 3.1.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong phần sinh khối B. subtilis natto22 3.1.2. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong dịch lọc môi trường nuôi cấy B. subtilis natto 24 3.2. Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto 28 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo nucleic B. subtilis natto Bacillus subtilis natto GGCX γ-glutamate carboxylase Gla Axit γ-carboxyglutamic HPLC High-performance liquid chromatography MK-7 Menaquinone 7 mmHg Milimet thủy ngân NF-κB Nuclear Factor-kappa B PGE2 Prostaglandin E2 rARN ribosomal Acid Ribonucleic VSV Vi sinh vật γ-PGA Gama polyglutamic acid v/v Thể tích/Thể tích w/v Khối lượng/Thể tích mARN messenger Acid ribonucleic TLC Thin layer chromatography DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 2.1 Nguyên liệu và hóa chất 15 2.2 Thiết bị sử dụng 16 3.1 Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch chiết sinh khối với pha động sắc kí là n-hexan:CH 2 Cl 2 (1:1, v/v) 23 3.2 Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc kí là n-hexan:CH 2 Cl 2 (1:1, v/v) 25 3.3 Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc kí là CHCl 3 :CH 3 OH (9:1, v/v) 25 3.4 Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc kí là CHCl 3 :CH 3 OH (20:1, v/v) 26 3.5 Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc kí là Etylacetat:n-hexan (7:3, v/v) 27 3.6 Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với hệ dung môi chiết là n-hexan:2-propanol (2:1, v/v) 31 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto 4 1.2 Công thức cấu tạo của MK-7 6 1.3 MK-7 ngăn chặn con đường của NF-κB truyền tín hiệu 8 1.4 Quá trình loại bỏ Calci ra khỏi động mạch 9 1.5 Các sản phẩm có chứa MK-7 11 2.1 Dụng cụ bình sắc kí 19 2.2 Bản mỏng sắc kí 21 3.1 Bản mỏng chạy sắc kí phần sinh khối với pha động sắc kí là n-hexan:CH 2 Cl 2 (1:1, v/v). 23 3.2 Bản mỏng tiến hành sắc kí với các hệ dung môi 25 3.3 Bản mỏng tiến hành sắc kí lớp mỏng với pha động n-hexan:CH 2 Cl 2 (1:1, v/v) 30 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, các bệnh loãng xương, gãy xương là những vấn đề về sức khỏe nghiêm trọng và chi phí chăm sóc y tế và quản lý là rất lớn. Ở Mỹ năm 1995, chi phí chăm sóc sức khỏe liên quan đến gãy xương do loãng xương là khoảng 13,8 tỷ USD [34]. Theo một nghiên cứu về tỉ lệ loãng xương ở bệnh nhân trên 50 tuổi ở bệnh viện đa khoa huyện Cái Nước tỉnh Cà Mau, kết quả cho thấy tỷ lệ loãng xương chiếm 21,53 % [11]. Ngoài ra các vấn đề về còi xương ở trẻ nhỏ cũng đang là một vấn đề cần được quan tâm. Một nghiên cứu cho thấy tỷ lệ còi xương ở trẻ em 1-36 tháng tuổi ở vùng miền núi phía Bắc là 14,4% [1]. Trước đây, con người thường ít quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức khỏe của xương từ lúc ban đầu và thường chỉ phát hiện ở giai đoạn sau của bệnh và thường phải dùng thuốc điều trị triệu chứng. Các thuốc điều trị loãng xương như Calci, vitamin D, Calcitonin. Tuy nhiên các thuốc này thường gây ra các tác dụng không mong muốn. Hiện nay, một số loại thực phẩm giúp phòng và điều trị loãng xương, giúp xương chắc khỏe có tác dụng rất tốt. Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK-7 [46]. Ngoài tác dụng trên xương MK-7 cũng đã được chứng minh ngăn ngừa quá trình vôi hóa thành mạch, cải thiện sức khỏe tim mạch [22]. Từ đây con người mới bắt đầu chú ý và nghiên cứu MK-7. MK-7 là một loại vitamin K2 có nguồn gốc tự nhiên, có trong các thực phẩm lên men đặc biệt có nhiều trong Natto - một loại thực phẩm truyền thống của người Nhật được lên men bằng cách ủ đậu tương nấu chín với Bacillus subtilis natto [9]. B. subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp MK-7 và khi thay đổi các điều kiện môi trường như nhiệt độ, cấp khí, dinh [...]... 2.2.1 Khảo sát sự có mặt của MK- 7 trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto Khảo sát sự có mặt của MK- 7 bằng sắc ký lớp mỏng trong: - Phần dịch lọc tách từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto - Phần sinh khối tách từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto 17 2.2.2 Lựa chọn hệ dung môi chiết MK- 7 từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto Khảo sát dung môi chiết dịch lọc tách từ môi trường nuôi cấy B subtilis. .. tới khả năng sinh tổng hợp MK7 của vi khuẩn Các nghiên cứu về MK- 7 phần lớn là ở nước ngoài còn trong nước vẫn chưa nghiên cứu được nhiều Dó đó, khóa luận Bước đầu khảo sát khả năng tạo MK- 7 từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto được thực hiện với hai mục tiêu: 1 Khảo sát sự có mặt của MK- 7 trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto 2 Lựa chọn dung môi chiết MK- 7 từ môi trường nuôi cấy B subtilis. .. tiến hành sắc kí lớp mỏng thì không có MK- 7 3.1.2 Khảo sát sự có mặt của MK- 7 trong dịch lọc môi trường nuôi cấy B subtilis natto Mục đích: Xác định sự có mặt của MK- 7 trong dịch lọc tách từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto Tiến hành: Môi trường nuôi cấy thu được tiến hành ly tâm thu phần dịch loại bỏ sinh khối Thể tích dịch thu được là 520 ml từ 5 bình nuôi cấy Tiến hành cô cất quay phần dịch ở... nếp nhăn [ 57] Các sản phẩm có chứa MK- 7: Natto: là nguồn thực phẩm từ đậu nành lên men có nguồn gốc từ Nhật Bản [44] 10 Một số loại thực phẩm lên cũng có chứa MK- 7 như phô mai, sữa đông [9] Một số loại thực phẩm chức năng có chứa MK- 7 như: MenaQ7, Vững cốt, Vipteen Hình 1.5 Các sản phẩm có chứa MK- 7 1.5 Lên men tạo MK- 7 từ Bacillus subtilis natto 1.5.1 Nuôi cấy vi sinh vật sản xuất MK – 7 Phương pháp... cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết thử,tính bằng cm b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm Rf: chỉ có giá trị từ 0 đến 1 22 CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Khảo sát có mặt của MK- 7 trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto 3.1.1 Khảo sát sự có mặt của MK- 7 trong phần sinh khối B subtilis natto Mục đích: Xác định sự có mặt của MK- 7 trong... natto 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtillis natto 1.1.1 Giới thiệu Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacilus, loài Bacillus subtilis được giáo sư S Sawamura phân lập lần đầu tiên từ quá trình lên men natto năm 1905 [36] Tên khác: Bacillus subtilis subsp natto; Bacillus subtilis var natto, Bacillus natto [36], B subtilis (natto) [24] 1.1.2 Phân loại khoa học Bacillus subtilis. .. 2002 [43] cho thấy B subtilis natto thuộc loài B subtilis, các khóa phân loại đã xếp B subtilis natto là một dòng thuộc loài B subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là khả năng lên men tạo natto [44], [38] Dòng B subtilis natto có nhiều loại như B subtilis natto N441 [1], B subtilis N18 [5], B subtilis natto B-12 [55], B subtilis natto N -77 [39] 1.1.3 Nguồn gốc B subtilis natto được giáo sư Shin... khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 40oC, cấy giống từ môi trường nhân giống sang môi trường 18 mới với tỷ lệ cấy truyền là 5% Lên men trong máy lắc ở 37oC trong các khoảng thời gian xác định [6], [10] 2.3.2 Phương pháp chiết MK- 7 từ môi trường nuôi cấy Nguyên tắc: Dùng các dung môi hữu cơ để tách các chất hòa tan trong dung dịch nhưng vẫn giữ được bản chất của nó Tiến hành: Lên men B subtilis natto. .. sự có mặt của MK- 7 trong sinh khối B subtilis natto thu được từ môi trường nuôi cấy Tiến hành: Lên men B subtilis natto trong 500 ml môi trường canh thang, ủ trong máy lắc 110 vòng/phút ở 37oC trong 6 ngày Sau 6 ngày, đem ly tâm môi trường nuôi cấy thu phần sinh khối Tiến hành chiết phần sinh khối với dung môi n-hexan:2-propanol (2:1, v/v) [13] Thể tích dung môi dùng là 120 ml Lắc bình chiết trong... 1.1.2 Phân loại khoa học Bacillus subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc: Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ: Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [48] Phân loại dưới loài: Bacillus subtilis natto [36] Từ kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể Bacillus subtilis natto và Bacillus subtilis của Seki năm 1 975 [36] và kết quả phân tích gen 16S rARN . MK-7 từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. 2. Lựa chọn dung môi chiết MK-7. NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ XUÂN CƯỜNG BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7 TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP. dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto. 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. 17 2.3.2. Phương pháp chiết MK-7 từ môi trường nuôi