ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  NGUYỄN THỊ HƯƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KIT CATT CHẾ TỪ KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở TRÂU, BÒ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Thú y Khoa : Chăn nuôi - Thú y Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên – 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM  NGUYỄN THỊ HƯƠNG Tên đề tài: NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA KIT CATT CHẾ TỪ KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở TRÂU, BÒ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Thú y Khoa : Chăn nuôi - Thú y Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : TS. Nguyễn Văn Quang Thái Nguyên – 2014 i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cũng như thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lý – VSATTP - khoa Chăn nuôi Thú y. Em đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các thầy, cô giáo trong khoa đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thành đầy đủ chương trình học cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y – trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Quang thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời biết ơn tới cô giáo GS. Nguyễn Thị Kim Lan, Ths. Phạm Thị Trang, đã chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ cho em trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô giáo trong trường cũng như các thầy cô giáo trong khoa Chăn nuôi thú y luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 05 tháng 12 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Hương ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1: Kết quả xác định độ nhạy độ đặc hiệu của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 39 Bảng 4.2: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT CATT trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 40 Bảng 4.3: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT khi bảo quản ở 0 0 C 42 Bảng 4.4: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT khi bảo quản ở nhiệt độ phòng (28 – 34 0 C) 42 Bảng 4.5: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT CATT khi bảo quản ở 0 0 C 43 Bảng 4.6: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT CATT khi bảo quản ở nhiệt độ phòng (28 – 34 0 C) 44 Bảng 4.7: Tổng hợp kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT 45 Bảng 4.8: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT sau 1 tháng bảo quản (ở 0 0 C) 46 Bảng 4.9: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT sau 3 tháng bảo quản (ở 0 0 C) 47 Bảng 4.10: Kết quả xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT sau 6 tháng bảo quản (ở 0 0 C) 48 Bảng 4.11: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT CATT sau 1 tháng bảo quản 48 Bảng 4.12: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT CATT sau 3 tháng bảo quản 49 Bảng 4.13: Kết quả chấm điểm ngưng kết để xác định độ ổn định của KIT CATT sau 6 tháng bảo quản 50 Bảng 4.14: Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT 50 iii DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1: Đánh giá kết quả sử dụng KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 36 iv CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADN : Acid deoxyribonucleic CATT : Card Agglutination Test for Trypanosomiasis cs : cộng sự EDTA : Ethylen Diamin Tetra Acetic IFAT : Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG : Isopropyl β – D – thiogalactoside KHKT : Khoa học kỹ thuật MSC : Màng sinh chất PBS : Phosphat Buffered Saline RNA : Ribonucleic acid SDS : Sodium Dodecyl Sulfat Se : Sensitivity Sp : Specificity T : Trypanosoma TAE : Tris – axit acetic – EDTA TMT : Tiên mao trùng TT : Thể trọng VAT : Variant Antigen Tupe VSG : Variant Surface Glucoprotein i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cũng như thời gian thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lý – VSATTP - khoa Chăn nuôi Thú y. Em đã nhận được sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các thầy, cô giáo trong khoa đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian qua để em có thể hoàn thành đầy đủ chương trình học cũng như hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa Chăn nuôi thú y – trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên, đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Quang thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn giúp em hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này. Em cũng xin gửi lời biết ơn tới cô giáo GS. Nguyễn Thị Kim Lan, Ths. Phạm Thị Trang, đã chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ cho em trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, em xin chúc các thầy cô giáo trong trường cũng như các thầy cô giáo trong khoa Chăn nuôi thú y luôn mạnh khỏe, hạnh phúc và thành công. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 05 tháng 12 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Hương vi 3.3. Nội dung nghiên cứu 34 3.3.1. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 34 3.3.2. Xác định điều kiện bảo quản của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 34 3.4. Phương pháp nghiên cứu 35 3.4.1. Phương pháp xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 35 3.4.2. Phương pháp xác định điều kiện bảo quản KIT theo nguyên lý CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng từ kháng nguyên tái tổ hợp RoTAT 1.2 37 3.5. Phương pháp xử lý số liệu 37 Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39 4.1. Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT trước khi bảo quản 39 4.1.1 Kết quả xác định độ nhạy độ đặc hiệu của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 39 4.1.2 Kết quả xác định độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 40 4.2. Kết quả nghiên cứu điều kiện bảo quản KIT 41 4.2.1. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT (sau 1 tháng bảo quản) 41 4.2.2. Xác định ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT khi bảo quản ở 0 0 C 46 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 5.1. Kết luận 53 5.2. Đề nghị 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm qua cùng với xu hướng phát triển chung của nền kinh tế, ngành chăn nuôi trâu, bò của nước ta cũng đang từng bước phát triển mạnh mẽ, nhằm đem lại những sản phẩm có chất lượng cao, đóng góp một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Ngành chăn nuôi trâu, bò càng phát triển kèm theo đó thì dịch bệnh xảy ra trên trâu, bò càng gia tăng gây nên những khó khăn trong công tác phát triển chăn nuôi trâu, bò ở nước ta. Gần đây, trâu, bò ở nước ta thường mắc bệnh tiên mao trùng (Trypanosomosis), đặc biệt ở các tỉnh miền núi có số lượng trâu bò lớn gây ảnh hưởng không nhỏ đến đàn vật nuôi. Bệnh tiên mao trùng (Trypanosomosis) là một bệnh ký sinh trùng truyền lây giữa người và gia súc do ký sinh trùng đơn bào (protozoa) lớp trùng roi (flagellata) gây ra. Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vavax, Trypanasoma siminae…. Bệnh tiên mao trùng hay còn gọi là bệnh ngã nước. Trâu, bò mắc bệnh thể cấp tính thường: sốt cao 41- 41,7 o C cùng với các triệu chứng thần kinh như: ngã quỵ, kêu rống, đi vòng tròn… trâu, bò bệnh sẽ chết sau 7 - 15 ngày. Ở thể mãn tính triệu chứng: sốt gián đoạn, gầy còm, da khô mốc, thiếu máu kéo dài, viêm phúc mạc, phù thũng 4 chân… Trường hợp bệnh nặng, con vật đột ngột sốt cao, bụng chướng to rồi lăn ra chết. Vì vậy cần có những nghiên cứu cụ thể về bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu, bò bằng nhiều phương pháp để chẩn đoán nhanh, chính xác thực trạng nhiễm bệnh và thử nghiệm các hóa dược đặc hiệu nhằm xây dựng phác đồ điều trị thích hợp. 2 Với sự phát triển của công nghệ sinh học nước ta hiện nay dựa trên nền tảng của sinh học phân tử, cung cấp nhiều phương pháp có ý nghĩa lớn trong y học phòng ngừa chẩn đoán và điều trị. Trong đó có phương pháp ứng dụng KIT được chế tạo theo nguyên lý CATT để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên trâu, bò. Xuất phát từ thực tế trên, được sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Văn Quang, sự phân công của khoa chăn nuôi - thúy y, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính của KIT CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò. - Xác định được điều kiện phù hợp nhất để bảo quản KIT CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp. 1.3. Ý nghĩa của đề tài. 1.3.1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về các điều kiện thích hợp để chế tạo và bảo quản KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) hiệu quả. Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán là hướng nghiên cứu công nghệ cao, khẳng định việc làm chủ công nghệ, đã và đang được ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tại Việt Nam. 1.3.2. Ý nghĩa trong thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình sản xuất KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng (Trypanosomiasis) từ kháng nguyên tái tổ hợp. [...]... nhau Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày Biểu đồ sóng tiên mao trùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt sóng yếu Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng Mỗi 11 đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề... viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao trùng được tiêm truyền (ước chừng khoảng 108 tiên mao trùng có thể gây viêm da - ở vị trí tiêm truyền), một số lượng lớn tiên mao trùng phát triển ở tại chỗ viêm này Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong bạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia theo chiều dọc Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải... rộng rãi ở các nước trên thế giới Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [21] đã bước đầu chế kháng nguyên tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta - Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng + Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA) Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh Phản... hiện kháng thể lưu động có trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T.evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường, và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao. .. biết về KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 2.1.2.1 Kháng nguyên RoTAT 1.2 của Trypanosoma evansi Kháng nguyên RoTAT 1.2 có bản chất là glycoprotein bề mặt của tiên mao trùng Theo Bajyana Songa và Hamers (1988) [32], kháng nguyên RoTAT 1.2 là kháng nguyên bề mặt chính của T.evansi, nó xuất hiện sớm ngay sau khi ký sinh trùng xuất hiện đồng thời không gây phản ứng chéo với kháng thể đặc hiệu của các loài... có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên theo phương pháp tách TMT để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán bệnh TMT cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao 20 + Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhất được ứng dụng để chẩn đoán bệnh. .. học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu - Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng Khi TMT ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ: + Phản ứng ngưng kết trên phiến kính (CATT/ T evansi: card... lâm sàng đặc trưng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, ngựa không phải lúc nào cũng phát hiện được Rất nhiều gia súc mang bệnh nhưng khó phát hiện các triệu chứng đặc trưng, nhất là đối với những gia súc mắc bệnh tiên mao trùng mãn tính Đối với gia súc mắc bệnh ở thể cấp tính, các biểu hiện bệnh đặc trưng là sốt cao, bỏ ăn, có triệu chứng thần kinh (điên loạn) và chết nhanh Trâu bị bệnh mãn tính có... được kháng nguyên này Vì vậy, công tác nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng bằng cách khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 2.1.2.2 Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi Tách dòng gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR đã được xử lý cắt đầu bằng vector tách dòng pJET1.2/blunt của. .. chứng: sốt gián đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng và chân sau, chết do kiệt sức (Phạm Sỹ Lăng, 1982 [12]) * Chẩn đoán thí nghiệm Có nhiều phương pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thí nghiệm, mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc Tùy từng trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp hoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp . đặc hiệu của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 39 4.1.2 Kết quả xác định độ ổn định của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ. kháng nguyên tái tổ hợp trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò . 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của KIT CATT chế từ kháng nguyên tái tổ hợp. tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 34 3.3.2. Xác định điều kiện bảo quản của KIT CATT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng chế từ kháng nguyên tái tổ hợp 34 3.4. Phương pháp nghiên cứu 35