BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. TRẦN ĐÌNH THẮNG NGHỆ AN - 2014 LỜI CẢM ƠN Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm và Môi trường - Trường Đại học Vinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Trần Đình Thắng - Phó trưởng khoa Hoá học, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo Th.S Hoàng Văn Trung - Khoa Hóa học - Trường Đại học Vinh đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi hoàn thành luận văn. PGS. TS Ngô Anh Trường Đại học Khoa học Huế giúp định danh mẫu nấm. ThS. Chu Thị Thanh Lâm - Trung tâm kiểm định An toàn thực phẩm và Môi trường - T.T Thực hành thí nghiệm - Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình sử dụng máy HPLC để đo mẫu. Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các cán bộ trong Khoa Hoá học - trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học. Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Vinh, tháng 10 năm 2014 Học viên Phạm Thị Nguyệt MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Lí do chọn đề tài 1 2. Mục đích nghiên cứu 2 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Nấm 3 1.1.1. Định nghĩa về nấm lớn 3 1.1.2. Phân loại nấm 3 1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng của nấm 3 1.1.4. Vai trò của nấm trong tự nhiên và trong đời sống con người 9 1.2. Axit amin 12 1.2.1. Định nghĩa và cấu trúc 12 1.2.2. Phân loại 14 1.2.3. Tính chất hóa lý của axit amin 16 1.2.4. Vai trò của các axit amin 17 1.2.5. Axit amin trong nấm 22 1.3. Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin 24 1.3.1. Các phương pháp sắc ký cổ điển 24 1.3.2. Phương pháp sắc ký khí 26 1.3.3. Phương pháp điện di mao quản 27 1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28 Chương 2. PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 31 2.1. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 31 2.1.1. Thiết bị và dụng cụ 31 2.1.2. Hóa chất 31 2.2. Phương pháp nghiên cứu 34 2.3. Thực nghiệm 34 2.3.1. Thu thập mẫu nấm 34 2.3.2. Xử lí mẫu 36 2.3.3. Tiến hành phân tích trên máy 39 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40 3.1. Nghiên cứu xử lý mẫu tối ưu 40 3.1.1. Khảo sát nồng độ HCl 40 3.1.2. Khảo sát thời gian thủy phân mẫu 44 3.2. Đánh giá phương pháp 48 3.2.1. Xây dựng các phương trình đường chuẩn và xác định khoảng tuyến tính 48 3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ của phương pháp 54 3.2.3. Xác định độ lặp lại, độ thu hồi của phương pháp 57 3.3. Xác định hàm lượng các axit amin trong các mẫu nấm 61 3.3.1. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin thủy phân 62 3.3.2. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin tự do 70 KẾT LUẬN 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 79 BẢNG KÍ HIỆU CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng Anh AOAC Hiệp hội các nhà hoá học phân tích chính thống Association of Official Analytical Chemists AQC Aminoquinolil- N- hydroxysuccinimidyl cacbamat Aminoquinolil- N- hydroxysuccinimidyl carbamate DM Chất khô dry matter EAA Axit amin thiết yếu Essential amino acid FMOC 9-florenylmetyl cloroformat 9-florenylmethyl cloroformate GC Sắc ký khí Gas chromatography GC/FID Sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa Gas chromatography/ flame ionization detector GC/MS Sắc ký khí khối phổ Gas chromatography/ mass spectrometry HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High performance liquid chromatography KPH Không phát hiện MeOH Metanol Methanol NEAA Axit amin không thiết yếu Nonessential amino acid OPA ortho-phtalandehit/ ortho- phtaldiandehit ortho-phthalaldehyd/ ortho- phthaldialdehyde PITC Phenylisothioxyanat Phenylisothiocyanate RP-HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược Reversed phase - High performance liquid chromatography TAA Tổng axit amin Total amino acid TEA Trietylamin Triethylamine THF Tetrahydrofuran Tetrahydrofuran DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn 13 Bảng 1.2: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axit amin cần thiết (mg/kg cân nặng/ngày) 21 Bảng 1.3: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu 21 Bảng 1.4: Thành phần axit amin thiết yếu trong một số loài nấm hoang (g/100g protein thô) 22 Bảng 1.5: Hàm lượng axit amin tự do trong loài nấm Calvatia gigantea ở phía Nam Thỗ Nhĩ Kỳ (mg/100 g ± SD) 23 Bảng 1.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) 24 Bảng 1.7: Thành phần axit amin không thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) 24 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi 40 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 44 Bảng 3.3: Sự phụ thuộc của diện tích pic sắc ký vào nồng độ (pmol/ l  ) của axit amin 48 Bảng 3.4: Giá trị LOD và LOQ của axit Aspartic 56 Bảng 3.5: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 56 Bảng 3.6: Độ lặp lại (n=5) hàm lượng các axit amin trong mẫu nấm lỗ 58 Bảng 3.7: Hiệu suất thu hồi của axit amin trong nấm lỗ 60 Bảng 3.8: Hàm lượng axit amin trong nấm lỗ 62 Bảng 3.9: Hàm lượng (μg/g) axit amin thủy phân trong các mẫu nấm 66 Bảng 3.10: Hàm lượng axit amin thủy phân trong các mẫu nấm tự nhiên 69 Bảng 3.11: Hàm lượng axit amin tự do trong mẫu nấm lỗ 71 Bảng 3.12: Hàm lượng axit amin tự do trong các mẫu nấm (μg/g) 75 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100 series 30 Hình 2.1: Mẫu nấm 03………………………………………………………35 Hình 2.2: Mẫu nấm 04………………………………………………………35 Hình 2.3: Mẫu nấm 05 35 Hình 2.4: Mẫu nấm lỗ……………………………………………………….35 Hình 2.5: Mẫu nấm 01………………………………………………………35 Hình 2.6: Mẫu nấm 02 35 Hình 2.7: Mẫu nấm 608 …………………………………………………….36 Hình 2.8: Mẫu nấm 619 …………………………………………………….36 Hình 2.9: Mẫu nấm 621 36 Hình 2.10: Mẫu nấm HKG 401 …………………………………………….36 Hình 2.11: Mẫu nấm HKG 406 36 Hình 2.12: Quy trình phân tích axit amin thủy phân 37 Hình 2.13: Quy trình phân tích axit amin tự do 38 Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl 41 Hình 3.2: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 5M 42 Hình 3.3: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 5,5M 42 Hình 3.4: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 6M 43 Hình 3.5: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01 tại nồng độ HCl 6,5M 43 Hình 3.6: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin vào thời gian thủy phân 45 Hình 3.7: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 16h 46 Hình 3.8: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 18h 46 Hình 3.9: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 20h 47 Hình 3.10: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01 tại thời gian thủy phân 24h 47 Hình 3.11: Đường chuẩn định lượng Asp 49 Hình 3.12: Đường chuẩn định lượng His 49 Hình 3.13: Đường chuẩn định lượng Thr . 49 Hình 3.14: Đường chuẩn định lượng Tyr 50 Hình 3.15: Đường chuẩn định lượng Ile 50 Hình 3.16: Đường chuẩn định lượng Glu 50 Hình 3.17: Đường chuẩn định lượng Ser 50 Hình 3.18: Đường chuẩn định lượng Gly 51 Hình 3.19: Đường chuẩn định lượng Ala 51 Hình 3.20: Đường chuẩn định lượng Arg 51 Hình 3.21: Đường chuẩn định lượng Leu 51 Hình 3.22: Đường chuẩn định lượng Cys - SS - Cys 52 Hình 3.23: Đường chuẩn định lượng Val 52 Hình 3.24: Đường chuẩn định lượng Met 52 Hình 3.25: Đường chuẩn định lượng Phe 52 Hình 3.26: Đường chuẩn định lượng Lys 53 Hình 3.27: Đường chuẩn định lượng Pro 53 Hình 3.28: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 10 pmol/ l  53 Hình 3.29: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 25 pmol/ l  54 Hình 3.30: Sắc đồ chạy hỗn hợp chuẩn 17 axit amin ở nồng độ 100 pmol/ l  54 Hình 3.31: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm lỗ 60 Hình 3.32: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân nấm lỗ thêm chuẩn 61 Hình 3.33: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 02 63 Hình 3.34: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 608 63 Hình 3.35: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 619 64 Hình 3.36: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 621 64 Hình 3.37: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm HKG401 65 Hình 3.38: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm HKG406 65 Hình 3.39: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 03 67 Hình 3.40: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 04 68 Hình 3.41: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân mẫu nấm 05 68 Hình 3.42: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm lỗ 72 Hình 3.43: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 01 72 Hình 3.44: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 02 73 Hình 3.45: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 619 73 Hình 3.46: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 621 73 Hình 3.47: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm HKG 401 74 Hình 3.48: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm HKG 406 74 [...]... (HPLC) là phương pháp phân tích đơn giản, nhanh, có độ tin cậy cao Trong những năm gần đây, HPLC được ứng dụng rộng rãi trong phân tích, đánh giá chất lượng thực phẩm như axit amin, vitamin, kháng sinh, phụ gia thực phẩm Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi lựa chọn đề tài : Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng. .. năng cao HPLC 2 Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp tách và định lượng đồng thời 17 axit amin trong các loại nấm khác nhau, cung cấp số liệu về thành phần dinh dưỡng (axit amin) trong một số loại nấm được nghiên cứu 3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu xác định các axit amin trên 2 loại nấm gồm: nấm nuôi cấy và nấm tự nhiên được thu thập từ rừng Quốc gia Pù Mát, Phong Nha Kẻ Bàng thuộc vùng. .. loài nấm này Tổng hàm lượng axit amin thết yếu và axit amin không thiết yếu trong nấm này lần lượt là 113,69 mg/100g và 85,96 mg/100g, axit amin thiết yếu chiếm hơn 56% tổng axit amin Như vậy, nấm là một nguồn lý tưởng của các axit amin thiết yếu, nấm C gigantea có một lượng giá trị axit amin thiết yếu 24 Bảng 1.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc (g/100g) (định lượng bằng. .. chiều cao, diện tích vết của mẫu so với vết mẫu chuẩn sẽ tính ra được hàm lượng các axit amin Phương pháp này tách tốt nhưng phải sử dụng dung môi rất độc, độ chính xác không cao Ngày nay, với sự phát triển của các phương pháp sắc ký hiện đại, việc tách và xác định axit amin không áp dụng trên sắc ký lớp mỏng nữa 25 1.3.1.2 Phương pháp sắc ký cột Phương pháp sắc ký cột là một phương pháp sắc ký cơ... là một nguồn thực phẩm cung cấp lượng axit amin cao Từ bảng 1.4 cho thấy nấm có đầy đủ các axit amin thiết yếu, hàm lượng axit amin thiết yếu trong nấm có thể được so sánh với trứng (loài Pleurotus florida có lượng axit amin thiết yếu tổng cao nhất 46,0% gần bằng 47,1% trong trứng) Tỷ lệ axit amin thiết yếu (EAA) trên tổng số axit amin (TAA) cho một ý tưởng về chất lượng dinh dưỡng của protein trong. .. velutipes 1.3 Các phương pháp tách và xác định đồng thời axit amin 1.3.1 Các phương pháp sắc ký cổ điển 1.3.1.1 Phương pháp sắc ký bản mỏng Phương pháp sắc ký bản mỏng được triển khai bởi Bailey J L rất dễ thực hiện [8] Vì thế nó cũng được sử dụng để xác định axit amin Tác giả Phạm Văn sổ và Bùi Thị Như Thuận (1978) đã dùng pyriđin làm dung môi triển khai chạy sắc ký bản mỏng, sau khi các axit amin được... cả các axit amin đều có đồng phân quang học (trừ glyxin) - Đa số các axit amin tự nhiên đều tồn tại ở dạng L - axit amin (chỉ ở dạng này thì các axit amin có giá trị dinh dưỡng cho con người và động vật) 1.2.4 Vai trò của các axit amin Các axit amin là cơ sở của sự sống bởi vì chúng đóng vai trò trung tâm trong việc xây dựng khối protein và còn là hợp chất trung gian của các quá trình trao đổi chất Axit. .. từng axit amin Trong tự nhiên axit amin tồn tại chính ở dạng α -axit amin, phần lớn các axit amin có bốn phần tử khác nhau có khả năng thay thế ở vị trí C-2 (Cα) Nguyên tử Cα không có trung tâm đối xứng nên các axit amin có đồng phân quang học là L - và D - axit amin, chỉ có glycin là không có đồng phân quang học (R = H) Trong tự nhiên chủ yếu tìm thấy ở dạng L - axit amin, D - axit amin chỉ tìm thấy trong. .. tổng hàm lượng tro Hàm lượng tro trong nấm thường chiếm từ 5-12% trọng lượng khô Nhìn chung, hàm lượng tro của nấm có phần cao hơn hoặc tương đương với hầu hết các loại rau Nấm chứa hàm lượng cao của photpho, kali và tương đối cao của magiê Tuy nhiên, một số nguyên tố còn lại sẵn có trong nấm vẫn chưa được biết hàm lượng Điểm lưu ý đặc biệt là sự tích tụ trong nấm vết kim loại nặng, đặc biệt là các. .. giản, nó là nền tảng của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sau này Phương pháp sắc ký cột với dẫn xuất sau cột dùng ninhydrin đã được áp dụng xác định axít amin từ những năm 1940 bởi Moore, S., Stein, W, H [4648] và sau này được nhiều tác giả áp dụng và cải tiến và được áp dụng trong xác định axit amin ở nhiều đối tượng khác nhau Nguyên lý cơ bản là axit amin được tách ra bằng cột trao đổi ion, . : Nghiên cứu xác định hàm lượng các axit amin trong một số loài nấm lớn ở vùng Bắc Trung Bộ bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC . 2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng phương pháp. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH PHẠM THỊ NGUYỆT NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM LỚN Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG. axit amin trong nấm lỗ 60 Bảng 3.8: Hàm lượng axit amin trong nấm lỗ 62 Bảng 3.9: Hàm lượng (μg/g) axit amin thủy phân trong các mẫu nấm 66 Bảng 3.10: Hàm lượng axit amin thủy phân trong các