TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ************ DƯƠNG THỊ MINH NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật HÀ NỘI - 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ************ DƯƠNG THỊ MINH NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Người hướng dẫn khoa học Th.S LA VIỆT HỒNG Th.S ONG XUÂN PHONG HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo Th.S La Việt Hồng và Th.S Ong Xuân Phong đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên khích lệ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp này. Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ đang công tác tại Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện, môi trường làm việc tốt nhất cho em thực hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài. Em xin cảm ơn tới toàn thể các thầy cô đang công tác tại khoa Sinh – KTNN, đó là những người đã cho em nguồn kiến thức vô cùng quý giá để em có thể hoàn thành tốt đề tài. Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn. Ngày 19 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện Dương Thị Minh LỜI CAM ĐOAN Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của em. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và xuất phát từ các nghiên cứu thực nghiệm mà chúng em đã tiến hành trên đối tượng Xạ đen và không trùng lặp với kết quả của tác giả khác. . Ngày 19 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện Dương Thị Minh DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) 13 Hình 1.2. Quả cây Xạ đen 13 Hình 3.1. Các bước tạo vật liệu vô trùng in vitro cây Xạ đen 23 Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện hiệu quả khử trùng của chất khử trùng 25 Hình 3.3. Mẫu vô trùng sống phát sinh chồi 27 Hình 3.4. Mẫu vô trùng nhưng không có khả năng phát triển (mẫu chết) 27 Hình 3.5. Khối mô sẹo sau 7 ngày theo dõi 28 Hình 3.6. Khối mô sẹo sau 15 ngày theo dõi 28 Hình 3.7. Chồi mới tạo ra và sinh trưởng mạnh 30 Hình 3.8. Chồi mới không phát triển 30 Hình 3.9. Không tạo chồi mới 31 Hình 3.10. Chồi mới tạo ra chậm phát triển 31 Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hệ số nhân chồi ở các môi trường của cây Xạ đen 31 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hiệu quả của các chất khử trùng với các nồng độ và thời gian xử lý mẫu 9 Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 17 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro 19 Bảng 3.1. Tạo vật liệu in vitro sau 5 ngày nuôi cấy 24 Bảng 3.2. Thời gian hình thành mô sẹo trên môi trường MS cơ bản có bổ sung nồng độ BAP khác nhau. 27 Bảng 3.3. Số chồi tạo thành, chiều cao chồi và hệ số nhân chồi của mẫu cấy trong các môi trường MS có bổ sung nồng độ BAP khác nhau 29 Bảng 3.4. Khối lượng tươi và khô của chồi đỉnh tái sinh in vitro. 32 Bảng 3.5. Nồng độ và hàm lượng diệp lục a (C a ), diệp lục b (C b ) và diệp lục tổng số (C a + b ), carotenoit tổng số (C x+c ). 32 CÁC TỪ VIẾT TẮT BAP: 6 – Benzyl amino Purine ĐC: Đối chứng CT: Công thức MS: Muashige and Skoog MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 NỘI DUNG……………………………………………………………………3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Nhân giống cây trồng in vitro 3 1.1.1. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) 3 1.1.2. Cơ sở khoa học chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 1.1.3. Ưu điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 1.1.4. Các giai đoạn nhân giống in vitro 6 1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nuôi cấy mô 8 1.2. Giới thiệu về cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) 12 1.2.1 Vị trí phân loại 12 1.2.2. Đặc điểm sinh học 13 1.2.3. Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới và ở Việt Nam 14 1.2.4. Công dụng 15 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu 16 2.2. Thời gian và địa điểm thí nghiệm 16 2.2.1. Trang thiết bị và dụng cụ 16 2.2.2. Môi trường nuôi cấy 16 2.2.3. Điều kiện nuôi cấy 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu sơ bộ 17 2.3.2. Bố trí thí nghiệm 17 2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu. 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1. Tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 22 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro của cây Xạ đen 27 3.2.1. Sự hình thành mô sẹo (callus) 27 3.2.2. Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi mới in vitro 29 3.3. Một số chỉ tiêu sinh lí của chồi đỉnh tái sinh in vitro 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC…………………………………………………………………… 37 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC GIẢ… 38 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ngày nay y dược học phát triển, cùng với nó là những bài thuốc dân gian cũng dần dần được tìm ra và một trong số những bài thuốc dân gian đó là tìm ra cây thuốc trong tự nhiên có những tác dụng ưu việt trong điều trị các bệnh ung thư, mụn nhọt của con người. Một trong nhưng cây thuốc dân gian đó là cây Xạ đen, nó có rất nhiều tác dụng và đóng vai trò không thể thiếu trong các bài thuốc cổ truyền. Hiện nay cây Xạ đen là loại cây nhỏ được trồng phổ biến ở các tỉnh như Sơn La, Hoà Bình, Hà Nam, Quảng Bình. Xạ đen được dùng trong y dược học cổ truyền Việt Nam để chữa các bệnh như viêm dạ dày, ung nhọt, trị khối u, ung thư, chống oxi hoá [12]. Tỷ lệ ung thư trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày càng tăng cao. Hiện trên thế giới mỗi năm có khoảng 12 triệu người được phát hiện mắc ung thư. Việt Nam cũng là quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh này thuộc loại cao. Thông tin này được đưa ra trong buổi phát động chiến dịch mang tên ”Ung thư cũng có thể ngăn ngừa” nhân ngày Ung thư thế giới (4/2), do Hiệp hội phòng chống ung thư thế giới (UICC) tổ chức. Theo thống kê của Bộ Y tế, năm 2006 tại Việt Nam đã có hơn 77.280 ca ung thư ác tính được phát hiện. Đứng đầu là ung thư vú với gần 8.400 ca, kế đến là ung thư cổ tử cung, gần 6.770 ca, ruột kết và trực tràng gần 6.290, dạ dày 5.860, khí quản, phế quản và phổi 5.800 ca [13]. Trong những năm gần đây việc sử dụng Xạ đen để điều trị bệnh ung thư được phổ biến rộng rãi vì vậy đã làm cạn kiệt nguồn cây tự nhiên. Việc trồng Xạ đen để cung cấp nguồn dược liệu còn hạn chế bởi nguồn giống, nguồn đất trồng… Quá trình nhân giống cây Xạ đen chủ yếu là dùng phương pháp giâm cành, phương pháp này có nhược điểm là phụ thuộc vào điền kiện mùa vụ [...]... được vào mùa xuân) cây Xạ đen lại có vai trò rất lớn trong các bài thuốc y dược học cổ truyền do vậy mà chúng tôi chọn đề tài Nghiên cứu tạo vật liệu in vitro và bước đầu nhân nhanh cây xạ đen bằng phương pháp tạo đa chồi để tạo ra nguồn cây giống nhanh và liên tục cung ứng cho nhu cầu về số lượng cây cho y dược học cổ truyền, phương pháp này có ưu điểm là nhân nhanh giống mà không phụ thuộc vào điều... 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu Các số liệu được xử lý thống kê trên chương trình Excel 2007 21 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen Vô trùng mô cấy ban đầu từ cây thực sinh Đây là bước quan trọng trong nuôi cấy mô cây Xạ đen Mục tiêu đạt được của thí nghiệm này là xác định được nồng độ của chất khử trùng javen, cồn và thời gian vô trùng mẫu mô ban đầu để tạo ra nguồn vật liệu. .. ta, Xạ đen phân bố chủ yếu tại các tỉnh Hà Nam, Quảng Ninh, Ninh Bình, Hòa Bình, Vườn quốc gia Cúc Phương, Vườn quốc gia Ba Vì, Thừa Thiên - Huế, Gia Lai 1.2.3 Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.3.1 Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở trên thế giới Từ năm 1977, tác giả Lưu Khải Thọ ở Trung Quốc đã bắt đầu nghiên cứu về cây Xạ đen, ông đã chiết xuất được chất Saponin Triterpenoid... Triterpenoid từ cây Xạ đen [16] Đến năm 1998, một chuyên gia Nhật Bản cũng đã chiết xuất được một chất có tác dụng hạn chế sự phát triển của ung thư từ cây Xạ đen Ở nước ngoài các nhà khoa học chủ yếu quan tâm nghiên cứu về thành phần các chất có trong cây Xạ đen và tác dụng của các chất đó đối với cơ thể [10] 1.2.3.2.Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở Việt Nam Mở đầu cho công trình nghiên cứu về cây Xạ đen đó... 5 lần 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 2.3.2.1 Thí nghiệm 1 Tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen Mẫu đỉnh sinh trưởng cây Xạ đen sau khi được khử trùng sơ bộ trong tủ cấy vô trùng ta sẽ tiến hành xử lý mẫu bằng chất khử trùng javel và cồn với các nồng độ và thời gian tương ứng được bố trí như ở bảng 2.1 Bảng 2.1 Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen Công thức Chất xử lý/ thời gian ĐC Xử lý sơ bộ... lý luận: bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro cây Xạ đen - Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào cây dược liệu Góp phần sản xuất và nhân nhanh cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt ứng dụng vào sản xuất cây trồng dược liệu phục vụ cho các ngành khoa học khác 2 NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhân giống cây trồng in vitro 1.1.1 Kỹ thuật... sau Các bước đơn giản tạo vật liệu in vitro từ đỉnh sinh trưởng của cây Xạ đen Bước 1 Thu đỉnh sinh trưởng mẫu Bước 2 Rửa sạch đỉnh sinh trưởng Xạ đen từ tự nhiên dưới vòi nước sạch 22 Bước 3.Xử lý bằng các chất khử Bước 4 Thấm khô mẫu trên giấy lọc trùng (xử dụng ống fancon) sau đó khô đã khử trùng và cắt mẫu dài rửa lại bằng nước cất khử trùng khoảng 2 – 2,5 cm từ 3 - 5 lần Bước 5: Cấy mẫu vào môi... về cây Xạ đen, và các nghiên cứu này tập trung chủ yếu vào nhân giống cây Xạ đen bằng kĩ thuật giâm, hom,… truyền thống 14 1.2.4 Công dụng Cây Xạ đen là một cây thuốc nam mọc tự nhiên trong các khu rừng của nước ta Công dụng của cây Xạ đen không chỉ về mặt y học mà nó còn có giá trị về mặt kinh tế, và đây cũng là cây trồng “xoá đói giảm nghèo” ở một số huyện của tỉnh Hoà Bình Cây Xạ đen có vị đắng... đích và nhiệm vụ 2.1 Mục đích Nhằm tạo ra một nguồn giống cây sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền với số lượng lớn để đáp ứng yêu cầu về cây phục vụ cho y dược học cổ truyền 2.2 Nhiệm vụ Vô trùng mẫu nuôi cấy để tạo cây in vitro Xác định ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro của cây Xạ đen Xác định một số chỉ tiêu sinh lý của chồi đỉnh tái sinh in vitro 3 Ý nghĩa lý luận và. .. Celastrus hindsii Benth Một số tên gọi khác của cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) như: cây Bách giải, cây Đồng triều, cây Bạch vạn hoa, dây gối, quả nâu, người Mường gọi là cây ung thư 12 Hình 1.1 Cây Xạ đen Hình 1.2 Quả cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) 1.2.2 Đặc điểm sinh học Xạ đen thuộc loại cây dây leo thân gỗ, mọc thành búi, dễ trồng, nhánh non tròn, không có lông, lá mọc cách và không rụng . đề tài Nghiên cứu tạo vật liệu in vitro và bước đầu nhân nhanh cây xạ đen bằng phương pháp tạo đa chồi để tạo ra nguồn cây giống nhanh và liên tục cung ứng cho nhu cầu về số lượng cây cho. SƯ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH – KTNN ************ DƯƠNG THỊ MINH NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI KHÓA LUẬN TỐT. Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 17 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro 19 Bảng 3.1. Tạo vật liệu in vitro sau 5 ngày nuôi cấy 24 Bảng