ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hàn Thị Thu Hương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH NẤM MỐC CHỊU NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2014 n LỜI CẢM ƠN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hàn Thị Thu Hương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH NẤM MỐC CHỊU NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Vũ Nguyên Thành PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà Hà Nội, 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS Vũ Nguyên Thành, Giám đốc Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm và PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học, Khoa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cán bộ Trung tâm Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp thực phẩm đã tạo điều kiện và chỉ bảo cho tôi để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Để có được ngày hôm nay tôi không thể quên được sự dìu dắt tận tình cùng những kiến thức quý báu mà các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô trong khoa Sinh học đã truyền dạy cho tôi trong suốt hai năm học tập tại trường. Tôi cũng xin dành tình cảm cho gia đình,bạn bè những người đã ở bên động viên, chia sẻ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian vừa qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên Hàn Thị Thu Hương MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 2 1.1.1. Lignocellulose 2 1.1.1.1. Cellulose 3 1.1.1.2. Hemicellulose 4 1.1.1.3. Lignin 6 1.1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose 7 1.1.2.1. Cellullase 7 1.1.2.2. Hemicellulase 10 1.1.2.3. Ligninase 12 1.2. Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose 13 1.2.1. Nấm mốc chịu nhiệt 13 1.2.1.1. Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt 13 1.2.1.2. Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biến 14 1.2.2. Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệt 17 1.2.2.1. Hoạt tính cellulase 17 1.2.2.2. Hoạt tính xylanase 19 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng 21 2.2. Hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị máy móc 21 2.2.1. Hóa chất 21 2.2.2. Dụng cụ và trang thiết bị, máy móc 22 2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 22 2.3.1. Môi trường Malt-glucose 2°Bx có bổ sung chloramphenicol 22 2.3.2. Môi trường PDA 22 2.3.3. Môi trường lên men lỏng 23 2.3.4. Môi trường YM 23 2.4. Phương pháp nghiên cứu 24 2.4.1. Phương pháp phân lập nấm mốc chịu nhiệt 24 2.4.2. Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào 24 2.4.3. Tách chiết enzyme 24 2.4.4. Xác định hoạt tính cellulase bằng DNS 24 2.4.5. Xác định hoạt tính CMCase, xylanase theo phương pháp DNS 26 2.4.6. Điện di protein 27 2.4.6.1. Phương pháp điện di SDS-PAGE 27 2.4.6.2. Phương pháp điện di Zymogram 28 2.4.7. Phương pháp tách chiết ADN tế bào nấm mốc 29 2.4.8. Phương pháp tinh chế ADN 29 2.4.9. Phương pháp tiến hành phản ứng PCR finger printing 30 2.4.10. Phương pháp điện di ADN 30 2.4.11. Nhuộm gel và đọc kết quả 31 2.4.12. Phương pháp phân loại nấm mốc dựa vào đọc trình tự rDNA 31 Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Kết quả phân lập, phân nhóm và định tên các chủng nấm mốc chịu nhiệt 33 3.1.1. Kết quả phân lập 33 3.1.2. Hình thái khuẩn lạc, tế bào 34 3.1.3. Phân nhóm bằng kỹ thuật fingerprinting 37 3.1.4. Định tên các chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA 38 3.2. Đặc tính của các chủng nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập 40 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose 40 3.2.2. Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocelulose 50 3.2.3. Kiểm tra khả năng hoạt động enzyme ở các pH khác nhau 52 3.2.4. Kiểm tra khả năng bền nhiệt của enzyme 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 KẾT LUẬN 64 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin trong phế phụ phẩm nông nghiệp phổ biến và rác thải Bảng 1.2. Tổng quan về ba nhóm enzyme cellulase nấm mốc và các đặc tính của chúng Bảng 1.3. Một số enzym hemicellulase và phân loại của chúng vào họ GH và CE Bảng 2.1. Thành phần gel chạy điện di protein Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR fingerprinting Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS Bảng 3.1. Danh sách các chủng nấm mốc phân lập được Bảng 3.2. Ký hiệu các chủng trong phổ fingerprinting Bảng 3.3. Tên phân loại của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt Bảng 3.4. Hoạt tính cellulase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt Bảng 3.5. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt Bảng 3.6. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt Bảng 3.7. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 Bảng 3.8. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc ở pH 3.0, pH 5.0, pH 7.0 Bảng 3.9. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng và 70˚C 20 phút Bảng 3.10. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc sau khi giữ ở nhiệt độ phòng và 70˚C 20 phút DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc lignocellulose Hình 1.2. Cấu trúc phân tử cellulose Hình 1.3. Cấu trúc arabino-4-O-methylglucuronoxylan trong cây gỗ mềm Hình 1.4. Cấu trúc O-acetyl-4-O-methylglucurono-ß-D-xylan trong cây gỗ cứng Hình 1.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng Aspergillus fumigatus Hình 1.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng Rhizomucor pusillus Hình 1.7. Khuẩn lạc và tế bào chủng Thermomyces lanuginosus Hình 1.8. Khuẩn lạc và tế bào chủng Scytalidium thermophilum Hình 3.1. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.1 Hình 3.2. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.3 Hình 3.3. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 5.5 Hình 3.4. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 10.4 Hình 3.5. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 112.2 Hình 3.6. Khuẩn lạc và tế bào chủng FCH 23.1 Hình 3.7. Phổ fingerprinting của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt Hình 3.8. Hoạt tính CMCase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt Hình 3.9. Hoạt tính xylanase của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt Hình 3.10. Ảnh điện di SDS-PAGE và zymogram CMC, xylan của 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp: Base pair (cặp bazơ) CBH: Cellobiohydrolase CBM: Carbohydrate-binding module CE: Carbohydrate esterase CMC: Carboxymethyl cellulose dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate DNS: Dinitrosalicylic acid EG: Endoglucanase FPU: Filter paper unit GH: Glycoside hydrolase ITS: Internal transcribed spacer PCR: Polymerase chain reaction (kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase) PDA: Potato Dextrose Agar SDS- PAGE: Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Luận văn thạc sĩ Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 1 MỞ ĐẦU Sự gia tăng tiêu thụ năng lượng, cạn kiệt nhiên liệu hóa thạch và ô nhiễm môi trường đã chuyển trọng tâm của thế hệ năng lượng theo hướng sử dụng nhiên liệu sinh học với nguyên liệu là chất thải giàu lignocellulose của các ngành lâm nghiệp, công nghiệp giấy và bột giấy, nông nghiệp và thực phẩm, rác thải đô thị rắn và chất thải động vật. Sản xuất nhiên liệu từ sinh khối lignocellulose, với thành phần chủ yếu là cellulose và hemicellulose sẽ tạo tiền đề cho sự phát triển bền vững. Mặc dù mang nhiều hứa hẹn, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học từ lignocellulose hiện nay vẫn chưa khả thi trong sản xuất thương mại. Vấn đề cốt lõi nằm ở tính bền vững của lignocellulose. Với hầu hết các công nghệ hiện hành, lignocellulose trước tiên cần được thủy phân thành các monomer để tạo tiền chất cho chuyển hóa sinh học hoặc hóa học. Trong công đoạn này, enzyme thủy phân lignocellulose thường được sử dụng. Tuy nhiên, với các hệ enzyme hiện có, quá trình thủy phân chưa thực sự hiệu quả về mặt kinh tế. Việc tìm kiếm các hệ enzyme hiệu quả hơn đang được quan tâm đặc biệt. Ngoài ứng dụng trong sản xuất nhiên liệu sinh học, enzyme thủy phân lignocellulose còn có nhiều ứng dụng thực tiễn trong chế biến nông sản, thực phẩm, trong chăn nuôi, công nghiệp giấy, trong sản xuất hóa chất, xử lý môi trường. Nội dung của đề tài nằm trong nỗ lực dài hạn nhằm khai thác đa dạng vi sinh vật nhiệt đới cho các ứng dụng công nghệ sinh học khác nhau, trong trường hợp này là tìm kiếm các enzyme thủy phân lignocellulose mới từ nấm mốc chịu nhiệt, nhóm vi sinh vật rất ít được nghiên cứu tại Việt Nam. Luận văn thạc sĩ Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 2 CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lignocellulose và enzyme thủy phân lignocellulose 1.1.1. Lignocellulose Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt với thành phần chủ yếu gồm hai polymer mạch thẳng là cellulose, hemicellulose và một polymer có cấu trúc ba chiều là lignin, trong đó cellulose được bao quanh bởi các phân tử hemicellulose và lignin (Hình1.1) [41]. Hình 1.1. Cấu trúc lignocellulose (Geert Potters 2010). Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau còn lignin là polymer của các phân tử dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này khác nhau giữa các loài, thậm chí khác biệt giữa các độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển [...]... 1.2 Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose 1.2.1 Nấm mốc chịu nhiệt 1.2.1.1 Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt Khái niệm “ưa nhiệt được sử dụng với vi sinh vật có thể sinh trưởng tốt trong điều kiện nhiệt độ cao, thường khoảng 45-122°C Khái niệm này thường chỉ được sử dụng đối với vi khuẩn đặc biệt là vi khuẩn cổ (vi khuẩn ở miệng phun núi lửa, suối nước nóng…) Trong giới nấm cũng có. .. Công nghiệp Thực phẩm) 1.2.2 Khả năng thủy phân lignocellulose của nấm mốc chịu nhiệt 1.2.2.1 Hoạt tính cellulase Hệ thống cellulase của nấm mốc chịu nhiệt cũng bao gồm ba enzym thủy phân: endo-(1,4)–β-D-glucanase, cellobiohydrolase và β-glucosidase [13] Một số loài nấm chịu nhiệt phân hủy cellulose mạnh nhưng cellulase tách chiết từ canh trường lại có hoạt tính rất thấp do sự phân hủy cellulose liên quan... khi đề cập tới nhóm nấm có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao Trong hơn bốn thập kỷ qua, nhiều loài nấm chịu nhiệt đã được phát hiện và nghiên cứu [56] Nấm mốc chịu nhiệt có mặt trong các loại đất và bên trong khối thực vật đang phân hủy Nấm mốc chịu nhiệt có thể tìm thấy trong phân ủ, đống cỏ khô, ngũ cốc được lưu trữ, vật liệu làm tổ của các loài chim và động vật, rác thải thành phố Các chất hữu cơ... trường ấm áp, ẩm ướt và hiếu khí cung cấp điều kiện sinh lý cơ bản cho phát triển của nấm mốc chịu nhiệt Nấm mốc chịu nhiệt phổ biến trong môi trường axit hơn nhiều hơn so với môi trường trung tính hoặc kiềm Chúng thuộc các nhóm phân loại không đồng nhất của các chi của Zygomycetes, Ascomycetes, Deuteromycetes và Mycelia Sterilia (nhóm nấm không tạo bào tử) [56] Khả năng chịu nhiệt của nấm không phải quá... của nấm mốc chịu nhiệt đều bền nhiệt, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 5580°C, pH 5.0-5.5 và hàm lượng carbohydrate khoảng 2-50% Exoglucanase (40-70 kDa) hoạt động tối ưu ở 50-75°C, các enzyme này đều là glycoprotein Các loại βglucosidase không đồng nhất và có khối lượng phân tử khoảng 45-250 kDa, hàm lượng carbohydrate khoảng 9-50% Nói chung, trừ tính bền nhiệt, đặc điểm phân tử của cellulase nấm mốc chịu. .. tồn tại lâu dài ở nhiệt độ 40-45°C Chỉ có khoảng 30 loài trong số khoảng 50.000 loài nấm được biết có thể sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ nêu trên Trong số đó, một số loài nấm cũng có thể phát triển được ở nhiệt độ 60-62°C 1.2.1.2 Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biến  Aspergillus fumigatus Aspergillus fumigatus là một loại nấm nguy hiểm nhưng khá thú vị và rất phổ biến bởi khả năng dinh dưỡng... kỵ nước, các tương tác có lợi của các chuỗi bên với lưỡng cực xoắn, và sự có mặt của proline tại đầu N của cấu trúc xoắn làm giảm sự tự do tạo hình của phân tử protein Hàn Thị Thu Hương K20 - Vi sinh vật học 20 Luận văn thạc sĩ CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 46 chủng nấm mốc chịu nhiệt được phân lập từ các mẫu đất, phân ủ, bã sắn ủ, rơm ủ,... ngoại bào Lignin không chứa những liên kết có thể thủy phân, tức là các enzyme phải là enzyme oxi hóa Năm 1938, Davidson phát hiện ra loại enzyme có khả năng thủy phân lignin có tên là: phenoloxydase Enzyme này được sinh tổng hợp bởi 1 số chủng nấm mốc Hiện nay các nhà khoa học đã chứng minh có 15 loại enzyme phenoloxydase và được gọi chung là ligninase Khi nghiên cứu về cơ chế tác dụng thì hệ enzyme này... hoạt động phân giải tốt hơn Phức hợp enzyme này liên kết với thành tế bào nấm, tương tự như cellulosome trong vi khuẩn [14] Điều này có thể giải thích khả năng phân giải cellulose mạnh mẽ của một số nấm chịu nhiệt 1.2.2.2 Hoạt tính xylanase Xylanase của nấm chịu nhiệt đang nhận được sự chú ý đáng kể vì nó có thể ứng dụng trong quá trình tẩy tắng bột giấy trong ngành công nghiệp giấy, bổ sung vào thức... glutamate và histidine và được tích điện âm như với các xylanase khác Natesh và cộng sự cho rằng cầu disulfide và cầu muối làm bền protein bằng cách giữ các cấu trúc bậc hai, góp phần vào tính bền nhiệt của các nếp gấp Tuy nhiên, khi TAX được so sánh với các xylanase khác của nấm mesophilic, không có mối tương quan giữa số lượng cầu muối và sự gia tăng tính bền nhiệt [50] Thay vào đó, tính bền nhiệt của . Ligninase 12 1.2. Nấm mốc chịu nhiệt và khả năng thủy phân lignocellulose 13 1.2.1. Nấm mốc chịu nhiệt 13 1.2.1.1. Đặc điểm nhóm nấm mốc chịu nhiệt 13 1.2.1.2. Một số nhóm nấm mốc chịu nhiệt phổ biến. nấm mốc chịu nhiệt đã phân lập 40 3.2.1. Khảo sát khả năng sinh enzyme thủy phân lignocellulose 40 3.2.2. Phân tích hệ protein và hệ enzyme thủy phân lignocelulose 50 3.2.3. Kiểm tra khả năng. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Hàn Thị Thu Hương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH NẤM MỐC CHỊU NHIỆT CÓ KHẢ NĂNG THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC