LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài “Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2”, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn tại phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung - Người đã tận tình hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này. Em cảm ơn chân thành tới các thầy cô và các bạn sinh viên đang học tập và làm việc tại Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình hoàn thành đề tài nghiên cứu. Cuối cùng em xin được cảm ơn gia đình, nhưng người thân, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn ! Hà nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị An Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài này là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận tốt nghiệp là trung thực nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị An Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN CÁC CHỮ VIẾT TẮT BC : Bacterial cellulose Cs : Cộng sự g : gam MT : Môi trường s : Diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm 2 ) s/v : Tỷ lệ diện tích bề mặt lên men trên thể tích dịch lên men tạo màng (cm 1 ) V : Thể tích dịch lên men tạo màng (cm 3 ) MUC LUC • 1.1. 1.5.1. Đặc điểm và tính chất của một số vật liệu dùng làm bình lên men • 10 1.5.2. 1.5.3 1.5.4. DANH MUC BẢNG 1.5.5. • 1.5.6. 1.5.7 1.5.8. DANH MUC HÌNH 1.5.9. • Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN 1.5.10 1.5.11. 1.5.12. 1.5.13. 1.5.14. 1.5.15. 1.5.16. 1.5.17. 1.5.18. 1.5.19. 1.5.20. 1.5.21. 1.5.22. 1.5.23. 1.5.24. 1.5.25. 1.5.26. MỞ ĐÀU 1. Lý do chọn đề tài Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN 1.5.27. Màng sinh học (Bacterial cellulose; Bioceỉỉulose; BC) có cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với nhau bằng liên kết P-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose, peptin và sáp nến Do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề chắc [13]. 1.5.28. Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người [9]. 1.5.29. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng Gluconacetobacter có khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ chủng Gluconacetobacter có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở để tạo ra màng trị bỏng cho người. Nhằm tìm kiếm được thiết bị tốt nhất lên Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN 1.5.30. men thu màng BC từ chủng Gluconacetobacter để tạo cơ sở cho sản xuất màng trị bỏng và nhiều ứng dụng khác tôi quyết định chọn đề tài: 1.5.31. “Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 ” 2. Mục tiêu của đề tài 1.5.32. Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 với giá thành rẻ có chất lượng tốt. 3. Nội dung của đề tài 3.1. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2. 3.2. Nghiên cứu lựa chọn vật liệu của thiết bị lên men tạo màng BC. 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng của vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2- 4. Ỷ nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học 1.5.33. Lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 với giá thành rẻ có chất lượng tốt. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN 4.2. Ý nghĩa thực tiễn 1.5.34. Tạo được màng BC với giá thành rẻ trên thiết bị đã chọn. 5. Điểm mới của đề tài 1.5.35. Tìm ra thiết bị phù hợp để tạo màng BC với hiệu quả cao nhất. 1.5.36. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về vỉ khuẩn Gluconacetobacter và màng BC 1.1.1. Phăn loại và đặc điểm hình thái của Gluconacetobacter 1.5.37. Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Gluconacetobacter thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi Gluconacetobacter như một loài phụ của A. acetỉ [14]. 1.5.38. Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, hiếu khí bắt buộc, hoá dị dưỡng. Tế bào của chúng thường tìm thấy trong giấm, dịch rượu, nước ép hoa quả, trong đất. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN 1.5.39. 1.5.40. Khuẩn lạc của Gluconacetobacter có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt 2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn [15]. 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Gluconacetobacter 1.5.41. Vi khuẩn Gluconacetobacter phát triển ở nhiệt độ 25-35°C, pH : 4-6. Nhiệt độ và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37°c, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay cả trong môi trường tối ưu.Gluconacetobacter có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ [1 0 ]. 1.5.42. Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của Gluconacetobacter bao gồm: Oxy hoá ethanol thành acid acetic, CƠ2 , H2 O; Phản ứng catalase dương tính; Không Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN 1.5.1. 1.5.2. Hình 1.1. Vi khuẩn Gluconacetobacter tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid; Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng hợp cellulose [1 0 ]. 1.1.3. Màng BC của vi khuẩn Gluconacetobacter 1.5.43. Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn Gluconacetobacter hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterỉal cellulose hay màng BC. * Cấu trúc của màng Bacterỉal cellulose: 1.5.44. Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme p -1,4 glucopynanose mạch thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu trúc và đặc tính lại khác xa nhau. 1.5.45. Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN 1.5.3. 1.5.4. TOMtm» MM'meQtA jw:iwv 1.5.46. Sợi cellulose của màng BC Sợi cellulose của thực vật 1.5.47. Hình 1.2. Cấu trúc cellulose 1.5.48. Chuỗi polyme ß -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo thành sợi nhỏ (,mbfibril) có kích thước l,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi lớn hơn- sợi vĩ mô ( micro fibril), những sợi này kết hợp với nhau tạo thành bổ và cuối cùng tạo dải ribbon. Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ l-9nm. Những dải ribbon được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác bằng liên kết hỉđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy [16]. 1.5.49. Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học cao, khả năng hấp thụ nước lớn. 1.5.50. Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn Gluconacetobacter được nghiên cứu đầu tiên bời Brown. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX, những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và đặc tính của cellulose [16]. 1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.2.1. Ảnh hưởng hàm lượng glucose Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN [...]... bị tốt nền ghép da ữong phẫu thu t [5], [6 ] 1.5 Tổng quan về thiết bị lên men 1.5.66 Thiết bị lên men thường có cấu tạo phù hợp với từng quá trình lên men: sản phẩm tạo ra, độ pH, yêu cầu kị khí hay thoáng khí Đối với lên men bề mặt, nhất là đối với lên men tĩnh thiết bị lên men rất đơn giản, thường chỉ có các bình lên men có bề mặt thoáng, rộng, có thiết bị thông khí Lên men tạo màng BC là lên men. .. 2.2.2.1 Nghiên cứu lựa chọn vật liệu của thiết bị lên men tạo màng BC 1.5.150 Thiết bị lên men phải có đặc tính bền với acid Bên cạnh đó, thiết bị lên men cũng phải chịu được nhiệt độ cao khi thanh trùng môi trường lên men (121°C) Chúng tôi tiến hành lên men ưong các bình chịu nhiệt làm bằng nhựa, inox, thủy tinh dựa trên các đặc điểm sau: bị ăn mòn bởi axit, có thể quan sát quá trình lên men, giá... văn thạc sĩ vi sinh học 2012 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình xử lý, bảo quản màng Bacterial cellulose từ chủng vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 _ 21 và ứng dụng điều trị bỏng” của Trần Linh Châm - ĐHSP Hà Nội đã nghiên cứu được thiết bị lên men thu màng đó là bằng nhựa là tốt nhất và nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng Gluconacetobacter tạo màng tốt nhất là s/v = 0,7 1.5.95... quản chủng giống Gluconacetobacter trên môi trường thạch nghiêng 1.5.149 Các chủng giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng (MT1), nuôi trong tủ ấm 3-4 ngày ở lạnh ở tủ 4°c 30°c Sau đó, giữ để bảo quản giống, cấy truyền giữ giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men tạo màng BC từ chủng. .. màng tốt nhất là s/v = 0,7 1.5.95 Chương 2 ĐỐI TƯƠNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 1.5.96 2.1 Đối tượng và thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Đổi tượng nghiên cứu 1.5.97 Chủng vi khuẩn Gluconacetobacter được phân lập từ màng của các nguồn nguyên liệu khác nhau nhờ quá ưình lên men giấm từ bia, giấm lên men theo phương pháp cổ truyền, chủng giống nhận từ phòng Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, trường Đại học Sư phạm Hà... Nội 2 1.5.8 1.5.9 1.5.229 Hình 3.3 Lên men tạo màng BC trong cốc inox 1.5.10 1.5.230 1.5.231 Nguyễn Thị An Hình 3.4 Lên men tạo màng BC trong cốc thủy tinh 250ml 10 K35C Khoa Sinh- KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 1.5.11 1.5.232 1.5.233 Hình 3.5 Lên men tạo màng BC trong hộp nhựa 500ml 1.5.234 Từ kết quả quan sát các bình lên men sau khi quá trình lên men trên kết thúc, kết hợp với quá... từ tự nhiên có tác dụng điều ưị bỏng Từ năm 2000 nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và Cs đã có một số công trình nghiên cứu về màng BC từ A xylỉnum và bước đầu nghiên cứu về các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong trị bỏng ở Việt Nam [6 ] Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN Khóa luận tốt nghiệp Đại học Sư phạm Hà Nội 2 1.5.92 Điều trị bỏng bằng các thu c... của bình lên men, rủi ro trong quá trình sử dụng 2.2.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các tỷ lệ s/v tới khả năng tạo màng của vi khuẩn Gỉuconacetobacter 1.5.151 S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm2) Nguyễn Thị An 10 K35C Khoa Sinh- KTNN Khóa luận tốt nghiệp 1.5.152 1.5.153 Đại học Sư phạm Hà Nội 2 V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm3) Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay... tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích dịch lên men để tìm tỷ lệ s/v thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ chủng Gluconacetobacter, chúng tôi tiến hành theo các bước sau: - Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC Quy đổi thể tích từ đơn vị ml sang đơn vị cm3 Sau đó tính tỷ lệ s/v 1.5.154 + Lên men của 2 loại bình lên men là: cốc đong thủy tinh loại 250ml có diện tích mặt... lượng BC cao [7] Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Gluconacetobacter 1.3.1 Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống 1.5.55 Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn Độ dai của màng phụ thu c rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men . tài 1.5.32. Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 với giá thành rẻ có chất lượng tốt. 3. Nội dung của đề tài 3.1. Nghiên cứu khả năng tạo màng BC từ chủng. ƠN Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài Nghiên cứu lựa chọn thiết bị lên men thu nhận màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 , em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu. Đối với lên men bề mặt, nhất là đối với lên men tĩnh thiết bị lên men rất đơn giản, thường chỉ có các bình lên men có bề mặt thoáng, rộng, có thiết bị thông khí. Lên men tạo màng BC là lên men tĩnh. 1.5.67.