VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TSKH. Phạm Văn Cường Hà Nội - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn: Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất của mình tới TSKH. Phạm Văn Cường đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện của luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Hội đồng Khoa học, Bộ phận đào tạo và các phòng chức năng đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hoá Sinh biển đã cổ vũ, động viên, tạo điều kiện cho tôi học tập và làm việc để tôi có thể thực hiện tốt các công việc của luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đoàn Thị Mai Hương và TS. Trịnh Thị Thanh Vân cùng các anh chị, các bạn đồng nghiệp của phòng Tổng hợp Hữu cơ và Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển thuốc – Viện Hóa Sinh biển đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi hoàn thành tốt bản luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Vũ Văn Nam MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT………………………… DANH MỤC CÁC BẢNG………………………………………………… DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ………………………………………………… DANH MỤC CÁC HÌNH…………………………………………………… DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC………………………………………………. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về vi sinh vật biển 3 1.1.1. Vi sinh vật 3 1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên 4 1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống 5 1.1.4. Vi sinh vật biển 5 1.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Việt Nam 6 1.3. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của vi sinh vật biển trên thế giới 11 1.3.1. Hoạt tính kháng lao 13 1.3.2. Hoạt tính chống ung thư 14 1.3.3. Hoạt tính khác 16 1.4. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học vi sinh vật biển Việt Nam 18 1.5. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu vi khuẩn Photobacterium. 20 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. Đối tượng nghiên cứu, xác định tên khoa học 22 2.2. Phương pháp lấy mẫu 22 2.3. Phương pháp phân lập chủng vi sinh vật biển 22 2.4. Phương pháp nuôi cấy 22 2.5. Phương pháp tách chiết các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy vi sinh vật 24 2.6. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Photobacterium sp. 24 2.7. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi sinh vật. 25 2.8. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 25 2.8.1. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 25 2.8.2. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 26 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 28 3.1. Xử lý mẫu và tách chiết, phân lập các chất từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. 28 3.2. Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được từ dịch ngoại bào nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. 31 3.2.1. Các chất phân lập được từ dịch chiết MeOH 31 3.2.2. Các chất phân lập được từ dịch chiết Etyl axetat 33 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được từ dịch chiết MeOH 37 4.1.1. Hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) 37 4.1.2. Hợp chất Uracil (FM7.3) 42 4.1.3. Hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) 42 4.2. Các chất phân lập được từ cặn Etyl acetat 43 4.2.1. N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) 44 4.2.2. Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) 48 4.2.3. Hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) 49 4.2.4. Hợp chất indole-3-carbonitrile (F3.3.1) 50 4.2.5. Hợp chất Thymine (F7.2) 51 4.2.6. Hợp chất 3-metyl pipererazine-2,5 dion (F8.2) 52 4.2.7. Hợp chất Axit benzoic (F2.2) 53 4.2.8. Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (F3.3.2) 53 4.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 54 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập 54 4.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN TỚI LUẬN VĂN 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT NMR: Nuclear Magnetic Resonance (phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 1 H-NMR: Phổ cộng hưởng từ proton 13 C-NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C DEPT: Distortionles Enhancement by Polarization Transfer (phổ DEPT) COSY: Homonuclear Correlated Spectroscopy HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (phổ HMBC) HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (phổ HMQC) HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence (phổ HSQC). NOE: Nuclear Overhauser Effect (hiệu ứng NOE) NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (phổ NOESY) s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet qui: quintet sxt: sextet sep: septet o: overlapping b: broad dd: doublet of doublets dt: doublet of triplets dq: doublet of quartets δ H , δ C : Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon. ppm: part per million (phần triệu). EIMS: Electron Inoniziation Mass Spectroscopy (phổ khối phun mù điện tử). HRMS: High Resolution Mass Spectroscopy (phổ khối phân giải cao) DMSO: Dimethylsulfoxide đnc: Điểm nóng chảy TLC: Thin Layer Chromatography (sắc ký bản lớp mỏng) CC: Column Chromatography (sắc ký cột) RP: Reverse Phase (sắc ký pha đảo) IC 50 Nồng độ tác dụng ức chế 50% tế bào thử nghiệm MIC Nồng độ ức chế tối thiểu HKTS Hiếu khí tổng số Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng Anh DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Số lượng một số nhóm vi sinh vật trong các mẫu nước biển và trầm tích tại Cát Bà 7 Bảng 1.2. Kết quả phân loại một số chủng vi khuẩn thuộc Cát Bà 8 Bảng 1.3. Kết quả phân loại một số chủng nấm men, nấm mốc, xạ khuẩn tại Cát Bà8 Bảng 1.4. Số lượng và số chủng vi sinh vật tách được trong các mẫu nước biển Việt Nam 9 Bảng 1.5.Xạ khuẩn từ đảo Cát Bà 11 Bảng 4.1. Dữ kiện phổ 1 H-NMR (CD 3 OD; 500 MHz) và 13 C-NMR (CD 3 OD; 125 MHz) của FM8.4 39 Bảng 4.2. Dữ kiện phổ 1 H-NMR (CD 3 OD; 500 MHz) và 13 C-NMR (CD 3 OD; 125 MHz) của F5.5 45 Bảng 4.3. Hoạt tính gây độc tế bào của các chất được phân lập 54 Bảng 4.4.Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của chất được phân lập 55 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1.Hình ảnh một số vi sinh vật 4 Hình 2.1. Một số hình ảnh trong quá trình phân lập chủng vi sinh vật 23 Hình 3.1.Sơ đồ chiết mẫu nuôi cấy chủng vi khuẩn Photobacterium sp. 28 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập cặn chiết MeOH 29 Hình 3.3.Sơ đồ phân lập cặn chiết EtOAc 30 Hình 4.1. Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ cặn MeOH 37 Hình 4.2. Phổ khối của FM8.4 38 Hình 4.3. Phổ 1 H-NMR giãn rộng của FM8.4 39 Hình 4.4. Phổ 13 C-NMR giãn rộng của chất FM8.4 40 Hình 4.5. Phổ COSY của chất FM8.4 40 Hình 4.6. Phổ HMBC của chất FM8.4 41 Hình 4.7. Một số tương tác chính trên phổ HMBC và COSY của chất FM8.4 41 Hình 4.8. Một số tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất FM4.2 43 Hình 4.9. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cặn Etyl acetat 44 Hình 4.10. Phổ khối của chất F5.5 45 Hình 4.11. Phổ 1 H-NMR của chất F5.5 46 Hình 4.12. Phổ 13 C-NMR của chất F5.5 47 Hình 4.13. Phổ COSY của chất F5.5 47 Hình 4.14. Phổ HMBC của chất F5.5 47 Hình 4.15. Tương tác chính trên phổ COSY ( ) , HMBC ( ) của chất F5.5 48 Hình 4.16. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.4 49 Hình 4.17. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F5.1 50 Hình 4.18. Tương tác chính trên phổ HMBC ( ) của chất F3.3.1 51 DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ của hợp chất 1-(pyrrolidine-2’-carbonyl)pyrrolidine-2-carboxamide (FM8.4) PL1 Phụ lục 2. Phổ của hợp chất Uracil (FM7.3) PL5 Phụ lục 3. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Gly) (FM4.2) PL7 Phụ lục 4. Phổ của hợp chất N-(2-oxoazepan-3-yl) acetamide (F5.5) PL11 Phụ lục 5. Phổ của hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (F5.4) PL15 Phụ lục 6. Phổ của hợp chất Cyclo-(Leu-Pro) (F5.1) PL19 Phụ lục 7. Phổ của hợp chất Indole-3-carbonitrile (F3.3.1) PL23 Phụ lục 8. Phổ của hợp chất Thymine (F7.2) PL27 Phụ lục 9. Phổ của hợp chất 3-methylpiperazine-2,5-dione (F8.2) PL29 Phụ lục 10. Phổ của hợp chất Axit benzoic (F2.2) PL31 Phụ lục 11. Phổ của hợp chất 4-(2-hydroxyethyl)phenol (F3.3.2) PL34 [...]... Cho tới nay, các loài vi sinh vật biển của nước ta chưa được khai thác về mặt hoạt tính sinh học, mặc dù đây là nguồn sản sinh các hợp chất thứ cấp quan trọng đối với các sinh vật biển cộng sinh Tuy nhiên, vi c thu lượng lớn các đối tượng sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi nhiều công sức và kinh phí Do vậy, vi c tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật sẽ là hướng... chiếm dưới 1% số loài trong thực tế Vi sinh vật biển từ lâu đã được biết đến như một trong số các nguồn tài nguyên quan trọng sản sinh các chất với cấu trúc hóa học đa dạng và có hoạt tính sinh học mới Ngoài ra, vi sinh vật biển cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống nhờ các tính chất đặc hiệu của chúng [1,2] 1.2 Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật biển Vi t Nam Vi t Nam có... ung thư của các hợp chất thứ cấp được các loài vi sinh vật biển sản sinh cũng cho thấy vi sinh vật biển là nguồn quan trọng trong nghiên cứu tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học Trong số các hợp chất này, nhiều hợp chất có chứa khung cấu trúc hóa học đặc biệt, chưa từng phát hiện từ các nguồn khác Các hợp chất lagunapyrones A-C (10-12), được phân lập từ xạ khuẩn (actinomycete, CNB-984) từ bùn biển. .. chính các vi sinh vật cộng sinh tạo ra Vi c thu lượng lớn các đối tượng sinh vật biển này cho nghiên cứu hóa học là rất khó khăn, đòi hỏi nhiều công sức và kinh phí Do vậy, nếu tiến hành nghiên cứu các hợp chất từ vi sinh vật, chỉ cần thu 1 lượng mẫu nhỏ phục vụ vi c phân lập vi sinh vật, sau đó tiến hành sinh khối với lượng lớn trong phòng thí nghiệm phục vụ vi c nghiên cứu hóa học 1 Trong khuôn khổ của. .. hữu hơn 1 triệu km2 vùng biển [1] Do vậy, vi c tiến hành nghiên cứu các hợp chất thứ cấp của nguồn vi sinh vật biển Vi t Nam nhằm phát hiện các chất có hoạt tính sinh học cao có thể nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực y dược là hướng nghiên cứu cần thiết, hứa hẹn nhiều triển vọng Ngoài ra, trong rất nhiều nghiên cứu về các đối tượng sinh vật biển như hải miên, san hô , các hợp chất phân lập được đã được... nguyên sinh vật biển đang là vấn đề cấp bách không chỉ nước ta mà trên toàn thế giới [1] Để có thể đánh giá và nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật biển, trong nghiên cứu về đa dạng sinh học vi sinh vật biển thuộc vùng biển Cát Bà, Hải Phòng, tác giả Lại Thúy Hiền và cộng sự (Vi n Công nghệ sinh học, Vi n HLKHCNVN) đã khảo 6 sát, phân tích và thống kê sự có mặt của vi sinh vật từ các mẫu nước biển Cát... từ trầm tích biển, nước biển, từ các đối tượng mà hoạt động hoặc bất động mà vi sinh vật có thể cộng sinh Hiểu được qui luật phân bố của vi sinh vật biển sẽ làm dễ dàng và tạo điều kiện thuận lợi để thu thập chúng từ các vật mẫu thích hợp cho vi c phân lập định hướng các nhóm vi sinh vật có hoạt tính sinh học đã được phân loại [1,2,10] Với mức đa dạng sinh học cao thì các vi sinh vật biển đóng vai... các công bố đã cho thấy vi sinh vật biển Vi t Nam rất đa dạng về chủng loại Trong số các loài đã được phát hiện là những loài mới, chưa được nhận 19 biết ở khu vực biển khác Chính vì vậy, đây là đối tượng có nhiều tiềm năng khai thác do các vi sinh vật biển đóng vai trò rất quan trọng trong môi trường sinh thái biển Các nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật biển của Vi t Nam cho tới nay hết... ung thư và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng cho vi c nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này 2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vi sinh vật biển 1.1.1 Vi sinh vật Vi sinh vật (Microorganism) là những sinh vật có kích thước rất nhỏ từ vài trăm nm đến vài nm, muốn thấy rõ chúng phải sử dụng kính hiển vi Vi sinh vật phân bố ở khắp mọi nơi trên... y dược Trong khi đó, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Vi t Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta là rất lớn nhờ vị trí địa lý tiếp giáp với biển [1,2,10] Vi t Nam có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển, với hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú Đất nước ta nằm trong khu vực biển Thái Bình Dương, . quan về vi sinh vật biển 3 1.1.1. Vi sinh vật 3 1.1.2. Vai trò của vi sinh vật trong tự nhiên 4 1.1.3. Vai trò của vi sinh vật trong đời sống 5 1.1.4. Vi sinh vật biển 5 1.2. Nghiên cứu về. Trong khi đó, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ nguồn vi sinh vật biển của Vi t Nam mới chỉ được bắt đầu, có rất ít các nghiên cứu đã công bố, mặc dù nguồn đa dạng vi sinh vật biển của nước ta. VI T NAM VI N HÓA HỌC VŨ VĂN NAM NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT NGOẠI BÀO CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐÁY BIỂN BẮC BỘ Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 60.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC