ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI – 2014 ĐẶNG NGỌC BÁCH ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẶNG NGỌC BÁCH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI CẦU GAI DIADEMA SAVIGNYI Chuyên ngành : Hóa hữu cơ Mã số : 60440114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoài Nam PGS.TS. Phan Minh Giang HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Luận văn này được thực hiện tại phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trong khuôn khổ Đề tài nghiên cứu cơ bản định hướng ứng dụng: “Nghiên cứu quy trình phân lập các hoạt chất có tác dụng diệt tế bào ung thư, kháng viêm và kháng khuẩn từ một số loài thuộc lớp Sao biển (Asteroidea), Hải sâm (Holothuroidea), Cầu gai (Echinoidea) thuộc ngành Da gai (Echinodermata) ở biển Việt Nam”. Trước tiên, với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Hoài Nam, Viện Hóa Sinh Biển và PGS. TS. Phan Minh Giang, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển đặc biệt là tập thể cán bộ phòng Dược liệu biển đã tạo điều kiện, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa hoc - Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Trong quá trình làm luận văn tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót. Vì vậy kính mong nhận được ý kiến đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô. Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học vi ên Đặng Ngọc Bách LỜI CAM ĐOAN Luận văn “Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai Diadema savignyi”. là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS. Nguyễn Hoài Nam và PGS. TS. Phan Minh Giang. Tôi xin cam đoan Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực, không trùng lặp và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khác. Hà Nội, tháng 10 năm 2014 Học vi ên Đặng Ngọc Bách MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai 3 1.1.1. Động vật học 3 1.1.2. Phân bố sinh thái 3 1.1.3. Các loài cầu gai dùng làm thực phẩm 4 1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai 5 1.2 Steroit từ một số loài sinh vật biển Việt Nam 8 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Đối tượng nghiên cứu 12 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 13 2.2.1. Sắc kí lớp mỏng (TLC) 13 2.2.2. Sắc kí lớp mỏng điều chế 13 2.2.3. Sắc kí cột (CC) 13 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 13 2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 14 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16 3.1. Kết quả 16 3.1.1. Xử lý mẫu và tạo dich chiết tổng 16 3.1.2. Phân lập các hợp chất 17 3.2. Thảo luận 20 3.2.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 20 3.2.1.1. Hợp chất DS1: 5α,8α-epiđioxi-cholest-6-en-3β-ol 20 3.2.1.2. Hợp chất DS2: Cholest-5-en-3β,7α-điol 25 3.2.1.3. Hợp chất DS3: Cholest-5-en-3β,7β-điol 28 3.2.1.4. Hợp chất DS4: 7β-metoxicholest-5-en-3β-ol 32 3.2.1.5. Hợp chất DS5: cholest-5-en-3β-ol 36 3.2.1.6. Hợp chất DS6: Natri cholest-5-en-3β-sunfat 40 3.2.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 45 KẾT LUẬN 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Tên đầy đủ 1 CC Column Chromatography 2 COSY Correlation Spectroscopy 3 DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer 4 SKLM Sắc kí lớp mỏng 5 TLC Thin Layer Chromatography 6 NMR Nuclear Magnetic Resonance 7 13 C-NMR Cacbon-13-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy 8 1 H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy 9 1 H- 1 H COSY 1 H- 1 H Chemical Shift Correlation Spectroscopy 10 HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence 11 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ Hình 1.1. Cầu gai S. droebachiensis 4 Hình 1.2. Cầu gai D. setosum 5 Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi 12 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Cầu gai Diadema savignyi 19 Hình 3.1.a. Phổ 1 H-NMR của DS1 20 Hình 3.1.b. Cấu trúc hóa học của DS1 20 Hình 3.1.c. Phổ 13 C-NMR của DS1 21 Hình 3.1.d. Phổ HMQC của DS1 21 Bảng 3.1. Các số liệu phổ NMR của DS1 22 Hình 3.1.e. Phổ HMBC của DS1 23 Hình 3.1.f. Phổ COSY của DS1 24 Hình 3.1.g. Các tương tác COSY (▬) và HMBC (  ) chính của DS1 24 Hình 3.2.a. Phổ 1 H-NMR của DS2 25 Hình 3.2.b. Cấu trúc hóa học của DS2 25 Hình 3.2.c. Phổ 13 C-NMR của DS2 26 Hình 3.2.d. Phổ HMQC của DS2 26 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của DS2 27 Hình 3.2.e. Phổ HMBC của DS2 28 Hình 3.2.f. Các tương tác HMBC chính của DS2 28 Hình 3.3.a. Phổ 1 H-NMR của DS3 29 Hình 3.3.b. Cấu trúc hóa học của DS3 29 Hình 3.3.c. Phổ 13 C-NMR của DS3 30 Hình 3.3.d. Phổ HMQC của DS3 30 Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của DS3 31 Hình 3.3.e. Phổ HMBC của DS3 32 Hình 3.3.f. Các tương tác HMBC chính của DS3 32 Hình 3.4.a. Phổ 1 H-NMR của DS4 33 Hình 3.4.b. Cấu trúc hóa học của DS4 33 Hình 3.4.c. Phổ 13 C-NMR của DS4 34 Hình 3.4.d. Phổ HMQC của DS4 34 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của DS4 35 Hình 3.4.e. Phổ HMBC của DS4 36 Hình 3.4.f. Các tương tác HMBC chính của DS4 36 Hình 3.5.a. Phổ 1 H-NMR của DS5 37 Hình 3.5.b. Cấu trúc hóa học của DS5 37 Hình 3.5.c. Phổ 13 C-NMR của DS5 38 Hình 3.5.d. Phổ HMQC của DS5 38 Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của DS5 39 Hình 3.5.e. Phổ HMBC của DS5 40 Hình 3.5.f. Các tương tác HMBC chính của DS5 40 Hình 3.6.a. Phổ 1 H-NMR của DS6 41 Hình 3.6.b. Cấu trúc hóa học của DS6 41 Hình 3.6.c. Phổ 13 C-NMR của DS6 42 Hình 3.6.d. Phổ HMQC của DS6 42 Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của DS6 43 Hình 3.6.e. Phổ HMBC của DS6 44 Hình 3.6.f. Các tương tác HMBC chính của DS6 44 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 46 Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ Đặng Ngọc Bách 1 Hóa hữu cơ LỜI MỞ ĐẦU Diện tích bề mặt trái đất vào khoảng 510.072.000 km 2 trong đó đại dương bao phủ hơn 3/4 tổng diện tích bề mặt. Đại dương không chỉ là nơi sinh sống của hàng ngàn loài động vật biển khác nhau mà còn ẩn chứa trong đó vô vàn điều bí ẩn chờ đợi con người tìm hiểu và khám phá. Việc nghiên cứu khai thác và sử dụng các nguồn lợi từ biển luôn là chủ đề nóng bỏng đối với các nhà khoa học trên khắp thế giới. Trong những năm gần đầy Việt Nam đã và đang có các công trình khoa học nghiên cứu về sinh vật biển, một trong các xu hướng mới mở ra là tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ sinh vật biển. Từ đó nghiên cứu thành phần, cấu trúc và tổng hợp nên các hợp chất có giá trị y học cao. Việt Nam là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới, có điều kiện thuận lợi cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau. Hơn thế với bờ biển kéo dài và thềm lục địa rộng lớn đó là nơi cất giấu kho nguyên liệu khoáng vật khổng lồ dưới dạng hòa tan, nắng đọng dưới đáy và vùi kín dưới đại dương. Trong sự đa dạng của sinh vật biển thì loài cầu gai là một trong những loài nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Ở Việt Nam cầu gai không những có giá trị ẩm thực mà con mang giá trị y học. Các công trình khoa học nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới cho thấy các hợp chất tách ra từ cầu gai có hoạt tính sinh học cao như kháng khuẩn kháng nấm, kháng viêm đặc biệt là khả năng ức chế các tế bào gây ung thư. Tuy nhiên ở nước ta những thông tin khoa học về loài này vẫn còn nhiều hạn chế, chưa có các nghiên cứu cụ thể làm sáng tỏ giá trị dược dụng của dược liệu quý này. Do đó, nội dung nghiên cứu của đề tài nhằm phát hiện các thành phần hóa học và hoạt tính sinh học quý báu góp phần minh chứng giá trị dược dụng của loài. Kết quả nghiên cứu sẽ làm tăng giá trị khoa học và thực tiễn góp phần khai thác và bảo tồn một cách có hợp lý nguồn tài nguyên cầu gai phong phú của đất nước. [...]... cm, gai dài đến 10 cm Vỏ và gai đều màu đỏ Loài Diadema savignyi, có vỏ đường kính 10 cm, gai dài đến 13 cm, vỏ màu lam-đen, có khi có đốm trắng trên gai Tại Việt Nam, Cầu Gai là một ăn thuộc loại “đặc sản” tại các vùng ven biển Phan Thiết Hình 1.2 Cầu gai D setosum (nguồn en.wikipedia.org) 1.1.4 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh. ..Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ Trên cơ sở đó, luận văn tốt nghiệp này tập trung vào: Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai Diadema savignyi Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần làm sáng tỏ tác dụng dược lý của nguồn dược liệu quý, đồng thời góp phần cho việc sử dụng hợp lý, hiệu quả và bảo tồn... tính sinh học đã được công bố trên thế giới cho thấy, thành phần hóa học chủ yếu của các loài da gai là các hợp chất steroit, saponin và cerebrosit Trong số năm lớp sinh vật thuộc ngành da gai, hai lớp sao biển (Asteroitea) và hải sâm (Holothuroidea) đã được tiến hành nghiên cứu khá chi tiết Rất nhiều công trình khoa học đã được công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai lớp sinh vật... biệt là các Đặng Ngọc Bách 5 Hóa hữu cơ Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ công bố về thành phần asterosaponin và cerebrosit từ các loài sao biển và các hợp chất saponin dạng khung holostan từ các loài hải sâm [6] Tuy nhiên, hiện còn rất ít các công trình nghiên cứu được công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sinh vật biển thuộc lớp cầu gai Từ những năm 1980, các hợp... chất từ loài cầu gai Diadema savignyi 2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được 3 Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đã phân lập được Đặng Ngọc Bách 2 Hóa hữu cơ Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Những nghiên cứu tổng quát về cầu gai 1.1.1 Động vật học Cầu gai hay còn gọi là nhím biển (hay nhum biển, chôm chôm biển) thuộc lớp cầu gai (Echinoidea)... 7βhiđroxi-cholesterol và dẫn xuất mới 7α-metoxi-cholesterol được phân lập từ loài rong sụn Kappaphycus alvarezii Nghiên cứu thành phần hóa học loài hải miên Dysidea cinerea cho thấy sự phong phú của nhóm chất steroit như các hợp chất ostreasterol, isofucosterol và 5,8-epiđioxicholest-6-en-3β-ol Hợp chất này cũng được phân lập từ loài hải miên Varius, X testudinaria và cầu gai Diadema setosum Nghiên cứu thành phần hóa học. .. Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Tên Việt Nam: Cầu gai Sa-vít - Tên khoa học: Diadema savignyi (Diadematidae) - Thời gian thu mẫu: 12/2011 - Địa điểm thu mẫu: Nha Trang - Người giám định loài: ThS Nguyễn Thị Mỹ Ngân, Viện Hải Dương học Nha Trang Mô tả, nhận dạng Hình 2.1 Cầu gai Diadema savignyi Màu sắc của con trưởng thành. .. (hay nhum biển, chôm chôm biển) thuộc lớp cầu gai (Echinoidea) ngành động vật da gai (Echinodermata), có hai phân lớp; cầu gai đều xuất hiện vào kỉ Silua và cầu gai không đều xuất hiện vào kỉ Jura Cầu gai có khoảng 800 loài hiện sống và 2.500 loài đã tuyệt chủng [3] Cầu gai còn được gọi là nhím biển hay cà ghim bởi xung quanh loài hải sản này là hàng trăm que nhọn như lông nhím, có đối xứng tỏa tròn bậc... bố từ các loài cầu gai Diadema setosum và D savignije [8] Năm 2004, nhóm nghiên cứu của GS Châu Văn Minh đã công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của hai hợp chất steroit là 5,8-epiđioxicholest-6-en-3-ol (1) và cholesterol cùng với glycerol 1-palmitat và glyxerol 1,3-đioleat-2-stearat từ cặn chiết metanol của loài cầu gai D setosum thu thập tại Hạ Long, Việt Nam Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc... từ san hô mềm Lobophytum laevigatum Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hợp chất lobophytosterol thể hiện hoạt tính mạnh trên ba dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là phổi, ruột và máu Đặng Ngọc Bách 10 Hóa hữu cơ Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn thạc sĩ (24S)-ergost-5-en-3β,7α-điol lobophytosterol Bên cạnh đó, các nghiên cứu về thành phần steroit của các loài da gai cũng thu được một số kết quả đáng quan . Thiết. Hình 1.2. Cầu gai D. setosum (nguồn en.wikipedia.org) 1.1.4. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cầu gai Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đã được công. 2014 Học vi ên Đặng Ngọc Bách LỜI CAM ĐOAN Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai Diadema savignyi . là công trình nghiên cứu. 2 Hóa hữu cơ Trên cơ sở đó, luận văn tốt nghiệp này tập trung vào: Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học loài cầu gai Diadema savignyi . Mục tiêu của đề tài: Nghiên