ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o TRẦN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP (Loop - mediated isothermal amplification) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC H NI – 2013 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN o0o TRẦN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP (Loop - mediated isothermal amplification) CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC MÃ SỐ: 62.42.40.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI 2. PGS. TS. KIỀU HỮU ẢNH H NI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trước tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Bộ môn Vi sinh vật học và các thầy cô trong Khoa Sinh học nơi đã đào tạo, dạy dỗ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt quá trình học tập của mình. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải - Viện Trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người hướng dẫn chính của tôi trong nghiên cứu này. GS định hướng nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có cơ hội tiếp cận với các khía cảnh mới của công nghệ sinh học và hoàn thành tốt luận án của mình, đồng thời luôn luôn động viên, khích lệ tôi trong công việc. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Kiều Hữu Ảnh là người đồng hướng dẫn của tôi. PGS đã là người chỉ đường, định hướng cho tôi không chỉ trong công việc chuyên môn mà truyền tải cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống của mình Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Nguyễn Thị Trung – Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học người đã cận kề cùng tôi trong công việc và dành nhiều thời gian thảo luận các phương pháp nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án của mình. Đồng thời, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi từ những ngày đầu làm việc nơi đây cho đến khi tôi hoàn thành toàn bộ kết quả luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến TS. Bùi Thị Việt Hà – Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện về mặt thời gian cho tôi trong thời gian làm luận án. Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới Bố-Mẹ tôi, người đã nuôi dưỡng và dạy dỗ tôi, Chồng và con là chỗ dựa tinh thần và nguồn động viên để tôi có đủ nghị lực để hoàn thành nhiệm vụ của mình. Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2013 TRẦN THỊ THANH HUYỀN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của một tập thể mà tôi là thành viên chính thức thực hiện các nghiên cứu. Các số liệu và kết quả thí nghiệm được trình bày trong luận án là trung thực và không trùng lặp với bất kỳ công trình nào khác. NGHIÊN CỨU SINH Trần Thị Thanh Huyền MC LC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ 6 1.1.1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus 6 1.1.2. Bệnh gan mủ thận 9 1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh 9 1.1.2.2. Đường lây truyền 11 1.1.2.3. Triệu chứng bệnh 12 1.1.2.4. Bệnh tích 13 1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh 16 1.1.2.6. Điều trị bệnh 16 1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri 18 1.2.1. Đặc điểm sinh học 18 1.2.2. Đặc điểm hệ gen 23 1.2.3. Độc tố gây bệnh và gen mã hóa độc tố gây bệnh 24 1.3. TÌNH HÌNH BỆNH DỊCH 24 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN Edwarsiella ictaluri 28 1.4.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 28 1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử 29 1.5. KỸ THUẬT LAMP (Loop- mediated isothermal amplifications) 30 1.5.1. Giới thiệu về kỹ thuật LAMP 32 1.5.2. Nguyên lý thiết kế mồi cho phản ứng LAMP 33 1.5.3. Cơ chế khuếch đại của phản ứng LAMP 35 1.5.4. Các phương thức phát hiện sự khuếch đại của phản ứng LAMP 38 1.5.4.1. Điện di trên gel agarose 38 1.5.4.2. Phát hiện dựa vào chất phát huỳnh quang 39 1.5.4.3. Phát hiện dựa vào sản phẩm phụ của phản ứng 40 1.5.5. Ưu điểm của phương pháp LAMP 42 1.5.6. Các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP tại Việt Nam 43 Chương 2. NGUYÊN LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC 46 2.1.1. Vật liệu 46 2.1.2. Hóa chất và máy móc thiết bị 47 2.2. PHƯƠNG PHÁP 48 2.2.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh 49 2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử 51 2.2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn 51 2.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli 51 2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose 52 2.2.2.4. Thiết kế và tổng hợp các cặp mồi 53 2.2.2.5. Kĩ thuật PCR và LAMP 55 2.2.2.6. Phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzym hạn chế 56 2.2.2.7. Ghép nối các đoạn DNA 57 2.2.2.8. Biến nạp DNA plasmid 58 2.2.2.9. Chọn lọc các thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp 59 2.2.2.10. Tinh sạch sản phẩm DNA plasmid bằng QIAGEN kit 59 2.2.2.11. Xác định trình tự nucleic acid 60 2.2.3. Tối ưu các điều kiện phản ứng LAMP 60 2.2.3.1. Xác định độ biến thiên Mg 2+ trong phản ứng 60 2.2.3.2. Xác định nồng độ Mg 2+ tối ưu 60 2.2.3.3. Xác định nồng dNTPs tối ưu 61 2.2.3.4. Xác định tỉ lệ mồi tối ưu 61 2.2.3.5. Xác định nồng độ betaine tối ưu 61 2.2.3.6. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu 61 2.2.3.7. Xác định thời gian phản ứng tối ưu 61 2.2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP 61 2.2.3.9. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP 62 2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào vật chủ 62 2.2.4.1. Thiết kế thí nghiệm cảm nhiễm 62 2.2.4.2. Xác định LD 50 63 2.2.4.3. Giải phẫu mô học 64 2.2.5. Xử lí số liệu bằng phần mềm vi tính 64 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66 3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA VIỆT NAM 66 3.1.1. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn 68 3.1.2. Nhuộm Gram 69 3.1.3. Khả năng di động, sinh indol và sinh H 2 S 69 3.1.4. Xác định hoạt tính catalase 72 3.1.5. Hoạt tính chondroitinase 73 3.1.6. Hoạt tính tan huyết 74 3.2. PHÂN LOẠI VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ 76 3.2.1. Tách chiết DNA genom của vi khuẩn 76 3.2.2. Phân loại bằng so sánh trình tự rDNA 16S 77 3.3. PHÂN LẬP, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E. ictaluri 79 3.3.1. Phân lập gen eip18 80 3.3.2. Tách dòng gen eip18 bằng vector pJet 2.1/blunt 81 3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen eip18 trong vector tái tổ hợp 81 3.3.4. Xác định trình tự gen eip18 83 3.4. THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM VI KHUẨN E. ictaluri 86 3.4.1. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E5 86 3.4.2. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E7 87 3.4.3. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E40 88 3.4.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm 91 3.4.5. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn 93 3.5. PHÁT HIỆN GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E. ictaluri BẰNG KỸ THUẬT LAMP 95 3.5.1. Khuếch đại gen eip18 bằng kỹ thuật LAMP 95 3.5.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP 97 3.5.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng 97 3.5.2.2. Ảnh hưởng thời gian phản ứng 98 3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng dNTPs 99 3.5.2.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ mồi 100 3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ betaine 100 3.5.2.6. Ảnh hưởng của nồng độ Mg 2+ 101 3.5.2.7. Ngưỡng phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP sử dụng chỉ thị Calcein 105 3.5.2.8. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng phương pháp LAMP 108 KẾT LUẬN 110 KIẾN NGHỊ 112 DANH MC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN NI DUNG LUẬN ÁN 113 TÀI LIỆU THAM KHẢO 114 PH LC [...]... hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal amplification” Mục tiêu của đề tài: - Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius hypophthalmus - Chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh trên các mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật LAMP 3 Nội dung nghiên cứu: - Phân lập vi khuẩn từ các mẫu cá tra bị bệnh gan thận mủ thu được tại khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long - Xác định một... chính xác tác nhân gây bệnh và có khả năng ứng dụng nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng không chỉ góp phần khẳng định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam mà còn có ý nghĩa quan trọng trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pagasius hypophthalmus. .. rằng tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra là hai loài vi khuẩn Hafnia alvei và Pleisiomonas shigelloides [11] Lý Thị Thanh Loan và cs năm 2007 ghi nhận kết quả nghiên cứu bước đầu tác nhân gây bệnh gan thận mủ ở cá tra là vi khuẩn Clostridium sp [7] Năm 2008, tác giả Đặng Thị Hoàng Oanh cùng các đồng nghiệp tại khoa Bệnh học thủy sản, Đại học Cần Thơ cũng xác định vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh. .. hydrophila bằng cả hai phương pháp ngâm và tiêm đã một lần nữa khẳng định E ictaluri là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage) [34] Như vậy, cho đến thời điểm này việc xác định chính xác đâu là tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra vẫn chưa có một câu trả lời thỏa đáng, nhưng có thể khẳng định vi khuẩn E ictaluri là một trong những đối tượng cần được nghiên. .. vào vấn đề kiểm soát bệnh dịch, giảm thiểu những tổn thất kinh tế cho người nuôi và các ngành kinh tế liên quan Tại Việt Nam, tuy đã có nhiều công trình nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra nhưng chưa có sự thống nhất về kết quả Năm 2001, Ferguson và cs đã công bố tác nhân gây bệnh là Bacillus sp [43] Một năm sau đó tác giả lại đính chính tác nhân gây bệnh là Edwardsiella... sóc và quản lý [2] Tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam vẫn còn là câu hỏi chưa có câu trả lời chính xác Bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1998 và gọi là bệnh BNP (Bacillary Necrosis of Pangasius) [43] Khi cá tra bị bệnh, biểu hiện bên ngoài không có gì đặc biệt, một số có hiện tượng xuất huyết ở các vây, có khi xuất... rằng đó là do vi khuẩn khác gây ra Như vậy, việc xác định tác nhân chính gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là vấn đề cần phải được làm sáng tỏ Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự có mặt của một tác nhân gây bệnh từ những phương pháp truyền thống như: phân lập trên môi trường chọn lọc, xác định đặc tính sinh lý, hóa sinh, phương pháp huyết thanh học… đến các phương pháp phân tử như... Các vi khuẩn phân lập từ cá tra bị bệnh gan thận mủ được định danh là E ictaluri dựa trên các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hoá [36] Còn ở khu vực Châu Á, Yuasa và cs lần đầu tiên phát hiện cá tra nuôi trong ao ở Sumatra, Indonexia có dấu hiệu bệnh lý tương tự như bệnh gan thận mủ và xác định tác nhân gây bệnh là E ictaluri vào năm 2003 [119] Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của Trần Thị Minh Tâm... khuẩn Gram dương, kỵ khí bắt buộc trong khi các tác nhân được công bố trước đây đều là trực khuẩn Gram âm [7] Còn tại Mỹ, các nhà khoa học đã khẳng định chính xác tác nhân gây hoại tử gan, thận và nhiễm trùng huyết trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus là vi khuẩn E ictaluri [94] Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định tác nhân gây bệnh gan thận mủ là E ictaluri nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại... Australia, Canada, Mehico, Nga… đạt giá trị 1,8 tỷ USD, tăng gần 26,5% với khối lượng xuất khẩu trên 600 nghìn tấn, tăng 3% so với năm 2010 [15] 8 1.1.2 Bệnh gan thận mủ Bệnh gan thận mủ hay còn gọi là bệnh đốm trắng nội tạng, bệnh hoại tử gan thận là một trong những bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi khuẩn gây ra Động vật thủy sản bị nhiễm bệnh và những xác động vật thủy sản bị bệnh chết là nguồn gây . THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP (Loop - mediated isothermal amplification) LUẬN. TRẦN THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP (Loop - mediated isothermal amplification) CHUYÊN. điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pagasius hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated