ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Hoàng Yến NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA NHÓM NẤM HYPHOMYCETES PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY MỤC (LITTER FUNGI) Ở MỘT SỐ RỪNG QUỐC GIA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội- 2014 LUẬN ÁN TIẾN SĨ LÊ THỊ HOÀNG YẾN 2014 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ HOÀNG YẾN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA NHÓM NẤM HYPHOMYCETES PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY MỤC (LITTER FUNGI) Ở MỘT SỐ RỪNG QUỐC GIA VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Dương Văn Hợp GS.TS Katsuhiko Ando Hà Nội - 2014 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình do chính tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng nghiệp khác. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần nội dung còn lại chưa được công ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Lê Thị Hoàng Yến 2 LỜI CẢM ƠN Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Dương Văn Hợp, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- người Thầy đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn và giúp tôi tháo gỡ những khó khăn trong suốt quá trình làm luận án. Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Katsuhiko Ando- Viện NITE Nhật Bản- người Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền lại cho tôi phương pháp mới về nghiên cứu sự đa vi nấm ở Việt Nam cũng như niềm say mê nghiên cứu về Khoa học Nấm. Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình về chuyên môn của các nhà Khoa học Nấm và các chuyên gia về enzyme vi sinh vật đang công tác tại Viện Công nghệ và Thẩm Định Quốc gia và Đại học Kyushu- Nhật Bản. Bên cạnh đó, tôi cũng nhận được sự động viên, góp ý khoa học của các bạn đồng nghiệp tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội. Bằng những tình cảm trân trọng nhất, tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy Cô giáo tại Bộ môn Vi sinh vật và Khoa Sinh học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã đào tạo, giảng dạy cho tôi những kiến thức cơ bản về Sinh học và vi sinh vật học. Tôi xin chân thành gửi lời cám ơn đặc biệt đến GS.TS Nguyễn Lân Dũng, người Thầy đã đặt nền móng cho sự nghiệp nghiên cứu nấm học của tôi. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn GS. TS. Phạm Văn Ty về sự nhiệt tình đóng góp ý kiến khoa học cho luận án của tôi được hoàn chỉnh hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện và tập thể cán bộ Viện Vi sinh vật Và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội và Ban Giám đốc Viện Công nghệ Thẩm Định NITE- Nhật Bản; Phòng Sau Đại học; Ban Giám hiệu- trường Đại Học Khoa học Tự Nhiên đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi học tập và tham gia nghiên cứu để hoàn thành luận án này. Tôi xin gửi lời cám ơn từ trái tim mình tới gia đình, những người thân và bạn bè đã luôn bên cạnh, yêu thương, khích lệ và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Lê Thị Hoàng Yến 3 MỤC LỤC Lời cam đoan 1 Lời cảm ơn 2 Mục lục 3 Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt 7 Danh mục các bảng 8 Danh mục các hình vẽ 9 MỞ ĐẦU 11 Chương1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 Đại cương về nấm 14 1.1.1 Nấm và các đặc điểm chung của nấm 14 1.1.2 Các nghiên cứu về tiến hóa về nấm 15 1.1.3 Hệ thống phân loại nấm 16 1.1.4 Phân loại học của nấm bất toàn (Mitosporic fungi hay microsporidia fungi) 17 1.1.5 Nhóm nấm Hyphomycetes 18 1.2. Các tiêu chí sử dụng trong phân loại Hyphomycetes bằng đặc điểm hình thái 19 1.2.1 Các đặc điểm khuẩn lạc 19 1.2.2 Các đặc điểm của sợi nấm và vách ngăn của sợi nấm 20 1.2.3 Hình thái các cơ quan sinh bào tử của vi nấm Hyphomycetes 21 1.2.4 Các kiểu phát sinh bào tử trần của nấm 22 1.2.4.1 Phát sinh bào tử dạng nảy chồi hướng gốc (Basipeptal): 22 1.2.4.2 Nảy chồi chuỗi hướng ngọn (Acropetal) 23 1.2.4.3 Phát sinh bào tử dạng tản (Thallic) 24 1.2.5 Các phương thức bào tử rời khỏi cuống: 24 1.3 Các tiêu chí sử dụng trong phân loại Hyphomycetes bằng phân tích trình tự gen ADN riboxom 25 1.3.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm và vai trò của chúng trong phân loại sinh học phân tử 25 1.3.1.1 Cấu trúc ADN riboxom của nấm 25 1.3.1.2 Vai trò của các đoạn ADNr trong phân loại nấm sợi 26 1.3.2 Vùng ADN mã hóa trong phân loại nấm(ADN barcoding fungi) 27 4 1.3.3 Phân tích sự phát sinh chủng loại 28 1.3.4 Một số phương pháp khác dùng trong phân loại nấm dựa vào phântích sinh học phân tử 29 1.3.5 Nghiên cứu phân loại giới nấm dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh 30 1.3.6 Nghiên cứu phân loại nhóm nấm Hyphomycetes dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh 32 1.4. Các bước tiến hành trong phân loại vi nấm 34 1.4.1 Phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự gen ADN riboxom 34 1.4.2 Phân loại một bậc phân loại nấm mới 34 1.4.3 Các nguyên lý cơ bản trong xác định danh pháp nấm (nomenclature) 35 1.5 Nấm tồn tại trên xác thực vật và các phương pháp phân lập chúng 36 1.5.1 Các dạng sinh thái của nấm 36 1.5.2 Nấm tồn tại trên xác thực vật 37 1.5.3 Các phương pháp phân lập nấm tồn tại trên xác thực vật 38 1.5.4 Một số kết quả nghiên cứu đa dạng vi nấm tồn tại trên xác thực vật ở một số nước trên thế giới 39 1.5.4.1 Ở Trung Quốc 39 1.5.4.2 Ở Ấn Độ 40 1.5.4.3 Ở Thái Lan 40 1.5.4.4 Ở Nhật Bản 41 1.5.4.5 Ở một số Quốc gia khác 41 1.5.5 Nghiên cứu đa dạng nấm ở Việt Nam 43 1.6 Một số loài nấm hyphomycetes có khả năng sinh enzyme phân hủy xác thực vật 43 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46 2.1 Nguyên liệu 46 2.1.1 Mẫu phân lập 46 2.1.2 Hóa chất và thiết bị 49 2.1.2.1 Hóa chất 49 2.1.2.2 Thiết bị 50 2.1.3 Môi trường 51 2.1.3.1 Môi trường phân lập, phân loại và giữ giống 51 2.1.3.2 Môi trường dùng cho nuôi cấy và thử hoạt tính enzyme của nấm 51 5 2.2 Phương pháp 51 2.2.1 Phương pháp phân lập nấm 51 2.2.1.1 Phân lập bằng phương pháp rửa bề mặt . 51 1.2.1.2 Phân lập bằng phương pháp tách bào tử đơn độc 53 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy bảo quản nấm sợi 56 2.2.3 Phân loại nấm sợi bằng quan sát hình thái 56 2.2.3.1 Quan sát khuẩn lạc và cấu trúc sinh bào tử dưới kính hiển vi thường 56 2.2.3.2 Quan sát hình thái cơ quan sinh bào tử của nấm dưới kính hiển vi điện tử quét 57 2.2.3.3 Quan sát số lượng nhân trong 1 tế bào của bào tử nấm dưới kính hiển vi huỳnh quang 58 2.2.4 Phân tích trình tự ADNr 18S hoặc 28S đoạn D1D2 của nấm 58 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học vi nấm 61 2.2.5.1 Tần suất xuất hiện (Frequency) 61 2.2.5.2 Chỉ số đa dạng sinh học loài H' (Shannon and Weiner's Index) 61 2.2.5.3 Chỉ số mức độ chiếm ưu thế hay còn gọi là chỉ số Simpson (Concentration of Dominance- Cd) 62 2.2.5.4 Chỉ số tương đồng (Index of similarity hay Sorensen’s Index- SI) 62 2.2.6 Sàng lọc enzyme phân giải CMC và xylan 62 2.2.7 Sàng lọc enzyme phân hủy lignin 63 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 3.1 Sự đa dạng của vi nấm về số lượng chủng nấm 64 3.2 Kết quả về đa dạng vi nấm hyphomycetes phân lập được ở 4 vùng sinh thái khác nhau ở việt nam 65 3.2.1 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Rừng Quốc gia Ba Bể 66 3.2.2 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở rừng Quốc gia Bạch Mã 68 3.2.3 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Mã Đà 71 3.2.4 Sự đa dạng vi nấm Hyphomycetes phân lập được rừng Quốc gia Phú Quốc 73 3.2.5 Thảo luận 75 3.2.5.1 Sự đa dạng vi nấm dựa vào chỉ số về mẫu và số lượng mẫu 75 3.2.5.2 Phát hiện sự đa dạng của vi nấm dựa vào phương pháp phân lập 76 3.2.5.3 Sự đa dạng thành phần loài vi nấm Hyphomycetes dựa vào các chỉ số sinh học 77 6 3.2.5.4 Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Lớp, Bộ, Họ 79 3.2.5.5 Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Chi, Loài 81 3.2.5.6 Sự đa dạng về mức độ tương đồng giữa các khu vực nghiên cứu 83 3.2.6. Mô tả hình thái của một số loài nấm mới ở Việt Nam 84 3.2.6.1 Polybatispora quinquecornuta Matsush. (1996) 84 3.2.6.2 Isthmolongispora genculata Tubaki de Hoog & Hennebert (1983) 85 3.2.7.3 Isthmolongispora ampulisformis Tubaki de Hoog & Hennebert (1983) 85 3.2.6.4 Isthmolongispora minima Tubaki de Hoog & Hennebert (1983) 85 3.2.6.5 Ceratosporella ponapensis Matsush. (1981) 86 3.2.6.6 Radiatispora yunaensis Matsush. (1996) 86 3.2.6.7 Lateriramulispora ainflata Matsush. (1975) 86 3.2.6.8 Scolecobasidium tricladiatum Matsush. (1971) 87 3.2.6.9 Triglyphium alabamense Matsush. (1981) 87 3.2.6.10 Varicosporium elodeae W. Kegel (1906) 87 3.2.6.11 Triramulispora obclavata Matsush. (1975) 88 3.2.6.12 Tripospermum myrti (Lind) S. Hughes 1951) 88 3.2.6.13 Tricladiella pulvialis K. Ando & Tubaki (1984) 89 3.3 Phát hiện một số chi, loài nấm mới 89 3.3.1 Hai chi nấm mới 90 3.3.1.1 Acerosispora L.T.H. Yen et K. Ando gen. et sp. nov. 90 3.3.1.2 Hamatispora L.T.H. Yen et K. Ando gen. nov. 97 3.3.2 Năm loài nấm mới 100 3.3.2.1 Condylospora vietnamensis L.T.H. Yen et K. Ando sp. nov. (VN05- F0030) 100 3.3.2.2 Trisulcosporium phuquocense sp. nov. (VN11-F0028) và Trisulcosporium exiguum sp. nov. (VN11-F0029) 103 3.3.2.3. Polylobatispora ambigua sp. nov. 106 3.3.2.4. Isthmolongispora phuquocensis sp. nov. (VN11-F0048) 109 3.4 Nghiên cứu đa dạng các chủng nấm sinh enzyme phân hủy lignocellulose 113 KẾT LUẬN 116 KIẾN NGHỊ 117 TÀI LIỆU THAM KHẢO 120 PHỤ LỤC 138 7 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT CMC Cacboxymethyl cellulose ADN Axit deoxyribonucleic DNS Axit 3,5 dinitrosalicylic dNTP 2'-deoxyribonucleocide-5'- triphosphate EDTA Axit Ethylene diamine tetra acetic nuc SSU rDNA (nuclear small subunit ribosomal DNA) ADN ribosome tiểu đơn vị nhỏ nucLSU rDNA (nuclear large subunit ribosomal DNA) ADN ribosome tiểu đơn vị lớn mitSSU rDNA ADN ribosome tiểu đơn vị nhỏ MnP Enzyme magan peroxidase LiP Enzyme lignin peroxidase RQG Rừng Quốc gia PCR (Polymerase Chain Reaction) Chuỗi phản ứng trùng hợp ARN Axit ribonucleic SGZ Sigingaldazine gen. nov. Chi mới sp. nov. Loài mới sp. Loài spp. Nhiều loài TSXH Tần suất xuất hiện 8 DANHMỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hệ thống phân loại nấm 17 Bảng 1.2 Một số enzyme do nấm sinh ra 44 Bảng 2.1 Đặc điểm địa lý các vị trí lấy mẫu 47 Bảng 2.2. Danh sách các mẫu lá rụng thu thập từ 4 rừng Quốc gia: Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc- Việt Nam 48 Bảng 2.2 (tiếp) Danh sách các mẫu lá rụng thu thập từ 4 rừng Quốc gia: Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc- Việt Nam 49 Bảng 3.1 Số lượng nấm phân lập từ các mẫu lá rụng thu thập từ 4 RQG của Việt Nam 64 Bảng 3.2 Tổng kết về kết quả nghiên cứu đa dạng vi nấm ở Việt Nam 65 Bảng 3.3 Sự đa dạng của vi nấm Hyphomycetes phân lập ở Rừng Quốc gia Ba Bể 67 Bảng 3.4 Đa dạng sinh học vi nấm Hyphomycetes trong rừng Quốc gia Bạch Mã 69 Bảng 3.5 Sự đa dạng sinh học của vi nấm trong rừng Quốc gia Mã Đà 72 Bảng 3.6 Sự đa dạng sinh học của vi nấm trong rừng Quốc gia Phú Quốc 73 Bảng 3.7. Các chi nấm chiếm ưu thế tại 4 RQG nghiên cứu 78 Bảng 3.8 Sự đa dạng sinh học của vi nấm ở mức độ Lớp, Bộ, Họ 80 Bảng 3.9. Số lượng và tỉ lệ phần trăm các chi, loài nấm phân lập được ở 4 RQG Việt Nam 81 Bảng 3.10 Mối tương quan giữa các khu vực nghiên cứu 83 Bảng 3.11 Danh sách những chủng nấm là chi, loài mới 90 Bảng 3.12 Kết quả phân tích trình tự ADNr 28S đoạn D1D2 của chủng VN11- F0004 dựa vào phần mềm Blastsearch 92 Bảng 3.13 So sánh hình thái bào tử giữa các loài trong chi Condylospora 101 Bảng 3.14 So sánh hình thái bào tử giữa các loài trong chi Trisulcosporium sp. 104 Bảng 3.15 So sánh hình thái bào tử giữa các loài trong chi Isthmolongispora sp. 110 Bảng 3.16 Khả năng sinh enzyme phân hủy lignocellulose của các chủng nấm nghiên cứu 114 [...]... được các dữ liệu về tính đa dạng sinh học của khu hệ nấm Hyphomycetesphân lập từ lá cây mục ở 4 rừng Quốc gia Việt Nam Phát hiện các chi, loài mới lần đầu được ghi nhận ở Việt Nam và phát hiện các chi, loài mới cho khoa học - Bảo tồn nguồn gen của khu hệ nấm Hyphomycetesphân lập từ lá cây mục thu thập ở các Rừng Quốc gia Việt Nam - Đánh giá hoạt tính enzyme phân giải lignocellulose của các chủng lựa... hành mang tính hệ thống về đa dạng vi nấm tồn tại trong các khu hệ sinh thái rừng Việt Nam Sự khác nhau về đa dạng sinh học các loài vi nấm nằm trong lớp lá rụng giữa các vùng miền có gì khác nhau? Để trả lời được các câu hỏi trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài "Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của nhóm nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục (litter fungi) ở các rừng Quốc gia Việt Nam " với các mục tiêu... của luận án: - Đây là nghiên cứu đầu tiên có hệ thống về đa dạng vi nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây rụng ở 4 vườn Quốc gia Việt Nam( Ba Bể, Bạch Mã, Mã Đà và Phú Quốc) , sử dụng hai kỹ thuật phân lập mới (phân lập nấm bằng phương pháp rửa bề mặt và phân lập nấm bằng phương pháp tách bào tử đơn độc) trong nghiên cứu đa dạng vi nấm tại Việt Nam - Nghiên cứu đã đưa ra một bức tranh đa dạng về nhóm nấm. .. Nghiên cứu về đa dạng nấm ở Việt Nam chưa được coi trọng, đến nay 11 theo ước tính có khoảng 2.900 loài nấm ở Việt Nam đã được lập danh lục [8; 11], trong đó vi nấm có khoảng 400 chi, 450 loài được công bố [8; 9; 11; 12], con số này cũng còn khá khiêm tốn so với sự đa dạng vi nấm ở Việt Nam Việt Nam là một nước có khí hậu nóng ẩm, vị trí địa lý kéo dài từ Bắc vào Nam, với sự đa dạng lớn về các vùng sinh. .. trong các nghiên cứu đa dạng chi, loài nấm mà chủ yếu dùng trong nghiên cứu đa dạng các thứ, các dòng nấm cụ thể hoặc dùng để phân tích mối quan hệ giữa loài vô tính và hữu tính (anamorph – teleomorph) 1.3.5 Nghiên cứu phân loại giới nấm dựa trên phân tích cây chủng loại phát sinh Năm 2004 Luitzoni và cộng sự đã tổng hợp các số liệu từ 560 công trình nghiên cứu về xây dựng cây phân loại nấm từ những... phần lớn chúng thuộc nấm túi, một số thuộc nấm đảm - Hyphomycetes: Nhóm nấm sinh bào tử trần từ cuống sinh bào tử và tế bào sinh bào tử mà không sinh ra trên đĩa giá hay thể đệm, phần lớn chúng thuộc nấm túi, một số ít thuộc nấm đảm 17 1.1.5 Nhóm nấm Hyphomycetes ấm Sự khác biệt về hình thái gi Hyphomycetes và 2 nhóm sinh sả vô tính còn giữa ản lại không rõ ràng, chẳng hạn như ở các chi Geotrichum... chủng nghiên cứu và các chủng gần gũi khác Giá trị Bootrap thể hiện tại phần gốc của nhánh, thông thường giá trị này >50% mới được thể hiện, nhưng một số tác giả lại lấy giá trị >65% (Hình 1.12) [49] 28 Hình 1.12 Ví dụ về một cây chủng loại phát sinh 1.3.4 Một số phương pháp khác dùng trong phân loại nấm dựa vào phântích sinh học phân tử Trong phân loại dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử, một số tác... 84 Hình 3.2 Một số loài nấm lần đầu tiên được phân lập tại Việt Nam (tiếp) 88 Hình 3.3 Một số loài mới lần đầu tiên được phân lập ở Việt Nam (tiếp) 89 Hình 3.4 Hình thái các cơ quan sinh sản của chủng VN11- F0004 90 Hình 3.5 Sự phát sinh bào tử của chủng VN11-F0025 quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét 91 Hình 3.6 Quan sát số lượng nhân trong một tế bào của bào tử nấm 93... Hình 1.14 Cây phát sinh chủng loại của nhóm nấm Hyphomycetes dựa vào trình tự đa gen [152] 33 1.4 CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH TRONG PHÂN LOẠI VI NẤM 1.4.1 Phân loại hình thái kết hợp với phân tích trình tự gen ADN riboxom Hiện nay trong phân loại nấm sợi, phương pháp phân loại chỉ dựa vào các đặc điểm hình thái cũng có thể công bố loài mới và trong các nghiên cứu đa dạng vi nấm Tuy nhiên để nghiên cứu có giá... Coelomycetes - Hyphomycetes Nấm nhầy (Mycomycotila) Myxomycota Plasmodiophoromycota Dictyosteliomycota Acrasiomycota 1.1.4 Phân loại học của nấm bất toàn (Mitosporic fungi hay microsporidia fungi) Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm, thường được gọi là nấm sợi Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes [1953] Lớp nấm bất toàn được . YẾN NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA NHÓM NẤM HYPHOMYCETES PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY MỤC (LITTER FUNGI) Ở MỘT SỐ RỪNG QUỐC GIA VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 40. nhau ở việt nam 65 3.2.1 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Rừng Quốc gia Ba Bể 66 3.2.2 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở rừng Quốc gia Bạch Mã 68 3.2.3 Sự đa dạng vi nấm phân lập được ở Mã. nấm Hyphomycetes phân lập từ lá cây mục (litter fungi) ở các rừng Quốc gia Việt Nam " với các mục tiêu sau: - Có được các dữ liệu về tính đa dạng sinh học của khu hệ nấm Hyphomycetesphân