BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP & PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM ĐỨC TRỌNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ LAI (Hispeastrum equestre) CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ Số: 60 62 01 10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN HẠNH HOA HÀ NỘI, 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn khoa học này là trung thực, chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào khác. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Phạm Đức Trọng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS.Nguyễn Hạnh Hoa - Bộ môn Thực vật - Khoa Nông học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã hướng dẫn tận tình, chỉ bảo cặn kẽ cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, cũng như trong suốt quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy giáo, Cô giáo cùng toàn thể các cán bộ nhân viên trong Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã quan tâm giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực hiện Luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện Luận văn tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Tác giả Phạm Đức Trọng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH viii PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu chung về cây Lan huệ 4 2.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại cây Lan huệ 4 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của Lan huệ tại Việt Nam 4 2.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của cây Lan huệ 6 2.1.4. Kỹ thuật trồng và chăm sóc 7 2.1.5. Giá trị kinh tế và sử dụng của cây Lan huệ 7 2.2. Tình hình sản xuất Lan huệ trong nước 9 2.3. Một số phương pháp nhân giống vô tính hoa Lan huệ 10 2.3.1. Phương pháp tách củ con 10 2.3.2. Phương pháp cắt lát (Chipping) 10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.3.3. Nhân nhanh In vitro 12 2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro 13 2.4. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở trong nước và trên thế giới 14 2.4.1. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ ở Việt Nam 14 2.4.2. Những nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Lan huệ trên thế giới 17 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1. Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18 3.1.1. Đối tượng 18 3.1.2. Vật liệu 19 3.1.3. Điều kiện nuôi cấy 20 3.1.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 20 3.2. Nội dung nghiên cứu 20 3.2.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất cytokinin: BA, Kinetin đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy 20 3.2.2. Giai đoạn nhân nhanh 21 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro 23 3.2.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 24 3.2.5. Giai đoạn vườm ươm 25 3.2.6. Các chỉ tiêu theo dõi 26 3.3. Phương pháp nghiên cứu 27 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 27 3.3.2. Phương pháp tiến hành 28 3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu 29 PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30 4.1. Giai đoạn nuôi cấy khởi động 30 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 4.2. Giai đoạn nhân nhanh 34 4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là cytokinin và auxin đến khả năng phát sinh chồi từ vảy củ đôi 34 4.2.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất cytokinin và auxin đến hệ số nhân nhanh chồi từ chồi in vitro 38 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường tới chất lượng chồi in vitro 43 4.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 47 4.5. Giai đoạn vườm ươm 53 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 5.1. Kết luận 62 5.2. Đề nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 67 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BA : Benzyl adenin Kinetin : 6-Furfury amino purine CT : Công thức ĐC : Đối chứng IBA : Indol butyric acid MS : Murashige and Skoog, 1962. MTN : Môi trường nền ND : Nước dừa PSHT : Phát sinh hình thái α-NAA : α naphty acetic acid Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu 30 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp BA và Kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy (Sau 4 tuần) 33 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của BA, kinetin và IBA đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ vảy củ đôi 36 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAA đến khả năng tái sinh chồi in vitro từ vảy củ đôi 36 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của BA, kinetin và α-NAA đến khả năng phát sinh chồi từ chồi in vitro 40 Bảng 4.6. Ảnh hưởng của BA, kinetin và IBA đến khả năng phát sinh chồi từ chồi in vitro 40 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa tới chất lượng chồi in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 44 Bảng 4.8. Ảnh hưởng của hàm lượng đường tới chất lượng chồi in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 44 Bảng 4.9. Ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ các dòng Lan huệ lai in vitro 49 Bảng 4.10. Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ các dòng Lan huệ lai in vitro 49 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây Lan huệ lai sau in vitro 55 Bảng 4.12. Ảnh hưởng của một số loại phân bón qua lá tới sự sinh trưởng ở vườm ươm của cây Lan huệ lai sau in vitro 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC BIỂU ĐỒ VÀ HÌNH Trang Biểu đồ 4.1. Ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ tạo rễ mới của cây Lan huệ lai sau in vitro 56 Hình 4.1. Ảnh hưởng của BA tới hệ số nhân chồi của sáu dòng lai hoa Lan huệ (Sau 4 tuần) 32 Hình 4.2. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa Auxin (α-NAA) và cytokinin đến khả năng nhân nhanh chồi từ vảy củ đôi hoa Lan huệ lai (sau 4 tuần nuôi cấy) 38 Hình 4.3. Kết quả nhân nhanh tối ưu từ chồi in vitro của 6 dòng lai Hoa Lan huệ (sau 4 tuần nuôi cấy) 42 Hình 4.4. Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa và hàm lượng đường tới chất lượng củ in vitro sau 4 tuần nuôi cấy 46 Hình 4.5. Ảnh hưởng α-NAA của đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ của sáu dòng lai hoa Lan huệ (Sau 4 tuần) 52 Hình 4.6. Ảnh hưởng của một số loại giá thể tới khả năng hình thành rễ cây con in vitro sau 4 tuần 57 Hình 4.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể tới cây Lan huệ lai ngoài vườn ươm 57 Hình 4.8. Ảnh hưởng của một số loại phân bón lá khác nhau tới các dòng lai hoa Lan huệ ngoài vườn ươm 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hoa đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm vừa mang giá trị tinh thần vừa mang giá trị kinh tế. Trong những năm gần đây, nước ta đã đạt được kết quả khả quan về phát triển kinh tế - xã hội. Đời sống của người dân được cải thiện nên nhu cầu về hoa ngày càng tăng, ngày càng đa dạng và phong phú cả về chủng loại và màu sắc. Một trong những loài hoa ngày càng được nhiều người yêu thích hiện nay là hoa Lan huệ được trồng trong chậu, trong cốc thủy tinh hoặc cắt cành. Lan huệ ((Hippeastrum equestre (Aiton) Herb.)), tên tiếng Anh là Valentine flower. Nếu như ở các nước Châu Âu, loài hoa này đã được sử dụng phổ biến làm quà tặng nhân dịp “Valentine” với nhiều giống hoa có màu sắc đa dạng thì ở Việt Nam, Lan huệ còn rất nghèo nàn về màu sắc (chủ yếu là màu đỏ), thời gian ra hoa của chúng lại muộn hơn (khoảng từ giữa tháng 3 đến cuối tháng 5) lệch với thời gian lễ “Valentine”. Như vậy để phát triển Lan huệ ở Việt Nam cần tiến hành nghiên cứu: Tăng độ đa dạng về màu sắc hoa và chọn tạo giống có thời gian ra hoa phù hợp với dịp có nhu cầu tiêu thụ của thị trường. Để nhân giống vô tính cây Lan huệ có thể sử dụng các phương pháp: Tách củ nhỏ từ cụm cây mẹ (Siddique và cs., 2007); kỹ thuật cắt lát ((Epharath J.E., Ben-Asher., Baruchin F., Alekperov C., Dayan E. & Silerbush M. (2001) hoặc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro (Husey, 1975; Seabrook và cs., 1976; De Buruyn, 1992; Chieh Li Huang và cs., 2005). So với phương pháp nhân giống in vitro thì các phuơng pháp nhân giống khác tuy đơn giản nhưng ít hiệu quả do thời gian nhân giống dài, hệ số nhân thấp. Trong khi đó, phương pháp nhân giống in vitro có rất nhiều ưu điểm như tạo được cây con sạch bệnh, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây [...]... liệu quý trên thì việc nghiên cứu nhân nhanh vô tính các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết Xuất phát từ những lý do nêu ở trên chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ lai (Hippeastrum equestre) 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định được các giai đoạn cơ bản trong quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro của một số dòng lai hoa Lan huệ Góp phần bổ sung... được nhu cầu cả về số lượng và chất lượng giống Bên cạnh đó, nhân giống in vitro các dòng Lan huệ lai còn phục vụ cho các công tác nghiên cứu chọn tạo giống mới bằng kỹ thuật gây đột biến, chuyển gen Năm 2010, Nguyễn Thị Phương Thảo và cs đã bước đầu xây dựng quy trình nhân nhanh hai dòng hoa Lan huệ mạng và Loa kèn đỏ nhung Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu chọn tạo giống hoa Lan huệ Tác giả Nguyễn... Nông nghiệp Page 17 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng, vật liệu, điều kiện, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng Đối tượng nghiên cứu: Sáu dòng Lan huệ lai H1, H3, H5, H12, H37, H85 (Hispeastrum esquestre).Các dòng lai là kết quả của phép lai hữu tính giữa các dòng bố mẹ sau: Ký hiệu dòng Lan huệ lai Nguồn gốc tổ hợp lai H1 ♂Đỏ Nhung x ♀ Trắng H3 ♂Đỏ Sọc Trắng x ♀ Đỏ... cây có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao Đồng thời, thời gian nhân giống ngắn, hệ số nhân giống cao, cây đồng nhất do vậy đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định, có thể cung ứng cho sản xuất trên quy mô rộng Đã có một số nghiên cứu bước đầu về nhân in vitro cây Lan huệ, các tác giả cho biết: Môi trường thích hợp nhất cho sự tạo chồi ở cây Lan huệ (Loa kèn đỏ... (MTN): MS + Nồng độ BA cho hệ số nhân tốt nhất ở thí nghiệm 1 + 30g/l saccaroza + 6,5 g/l agar Thí nghiệm 2 gồm 4 công thức như sau: CT1: MTN + 0,5 mg/l Kinetin CT2: MTN + 1,0 mg/l Kinetin CT3: MTN + 1,5 mg/l Kinetin CT4: MTN + 2,0mg/l Kinetin 3.2.2 Giai đoạn nhân nhanh 3.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của sự phối hợp hai nhóm chất auxin/cytokinin đến khả năng phát sinh chồi in vitro từ vảy củ đôi Trong nuôi... TS.Nguyễn Thị Phương Thảo và cộng sự đã nghiên cứu nhằm tìm ra các thông số thích hợp hướng tới nhân giống in vitro cây Lan huệ mạng (Hispeastrum reticulatum var striatifolium) [13],[14] Trên môi trường nền MS có bổ sung BA mẫu tái sinh chồi và củ in vitro cao Chồi và củ in vitro tiếp tục được sử dụng cho thí nghiệm nhân nhanh và cũng thu được kết quả rất tốt Các cây con in vitro Học viện Nông nghiệp Việt... độ chất điều tiết sinh trưởng khác nhau Thậm chí một số cây con cũng phát sinh trong trường hợp không có chất điều tiết sinh trưởng Cây con cũng cảm ứng phát sinh rễ ngay vào trong môi trường tổng quát mà không cần tới chất đặc biệt nào được yêu cầu [15] Hussey, 1975 cũng đã nghiên cứu nhân giống in vitro trên một số giống cây trong đó có Hippeastrum, ông chỉ ra rằng có thể nhân in vitro trên quy mô... Lan huệ đang được nghiên cứu về một số tác động dược học Trong số các alkaloids, lycorine (tên cũ Narcissine) là chất được chú ý nhất Narcissine được cô lập vào 1578, là một alkaloid rất bền Đến 1920, narcissine được chứng minh là có cùng cấu trúc với lycorine, trích từ Lycoris radiata, và từ đó tên narcissine bị bỏ Lycorine là một alkaloid loại isoquinolone (chuyển hóa từ phena thridine), có phân tử... các chất điều tiết sinh trưởng để kích thích mẫu cấy hình thành chồi bất định, các phôi vô tính hay kích thích các chồi nách, mắt ngủ bật mầm 2.3.3.4 Giai đoạn nhân nhanh Là giai đoạn quan trọng của quá trình nhân giống in vitro vì giai đoạn này xác định hệ số nhân của quá trình nhân giống in vitro Môi trường nuôi cấy nhân tạo có các chất điều tiết sinh trưởng như: Auxin, Cytokinin, đồng thời phải chú... Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) = Σ Số mẫu PSHT Σ Số mẫu nuôi cấy × 100 Σ Số chồi tạo thành Σ Số mẫu nuôi cấy ban đầu Giai đoạn nhân nhanh: 6 – 8 tuần * Nhân nhanh từ vảy củ đôi 3 Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu) = Σ Số chồi tạo thành Σ Số mẫu nuôi cấy 4 Chiều cao TB của chồi (cm) = = 5 Số lá TB của chồi (lá/chồi) Σ Chiều cao các chồi theo dõi Σ Số chồi ban đầu Σ Số lá các chồi theo dõi Σ Số chồi ban đầu * Nhân . trình kỹ thuật nhân giống in vitro của một số dòng lai hoa Lan huệ. Góp phần bổ sung và hoàn thiện quy trình nhân in vitro nhằm nhân nhanh một số dòng Lan huệ lai (Hippeastrum equestre). 1.2.2 VIỆT NAM PHẠM ĐỨC TRỌNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO MỘT SỐ DÒNG LAN HUỆ LAI (Hispeastrum equestre) CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ Số: 60 62 01 10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN. các dòng Lan huệ trên là rất cần thiết. Xuất phát từ những lý do nêu ở trên chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng Lan huệ lai (Hippeastrum equestre) . 1.2.