ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM  TIỂU LUẬN Đề tài: “ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH” Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Học viên thực Lớp : Nguyễn Thị Thanh Vinh : LL&PPDH môn Sinh học K22 Huế, 1/1/2014 GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS Nguyễn Bá Lộc tận tình giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu Tuy có nhiều cố gắng, chắn tiểu luận tơi cịn có nhiều thiếu sót Rất mong nhận góp ý thầy giáo bạn lớp Xin chân thành cám ơn! MỤC LỤC -2- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ Phần II: NỘI DUNG II.1 Sinh học phân tử II.1.1 Khái niệm II.2 Ứng dụng chẩn đoán bệnh 14 Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 III.1 Kết luận .36 III.2 Đề nghị 36 Phần IV: TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 -3- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ Sang kỉ XXI, khoa học – cơng nghệ có bước phát triển nhảy vọt Nhiều cơng trình nghiên cứu, nhiều thành tựu đời đáp ứng đảm bảo nhu cầu sống cho người ngày tốt Y học kỷ XXI có bước tiến dài, đạt kết khả quan: Nhiều bệnh hiểm nghèo chặn đứng, nhiều bệnh khác có triển vọng tìm cách điều trị, … Tất điều đạt nhờ ứng dụng ngành Sinh học phân tử vào y học Sinh học phân tử môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay tượng sinh học mức độ phân tử Cũng nhiều ngành khoa học khác, Sinh học phân tử thời gian qua phát triển mạnh mẽ thành tựu ứng dụng có hiệu lĩnh vực khác y học, mang lại hội cho nhiều bệnh nhân, mở triển vọng y học phát triển tương lai Nhận thấy tầm quan trọng lợi ích to lớn mà Sinh học phân tử mang lại cho y học liên quan trực tiếp đến sức khỏe đời sống vấn đề mang tính thời nên em chọn đề tài “Ứng dụng Sinh học phân tử chẩn đoán bệnh” với mong muốn mở mang kiến thức môn học Sinh học phân tử cập nhật thành tựu y học -4- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần II: NỘI DUNG II.1 Sinh học phân tử II.1.1 Khái niệm Sinh học phân tử (molecular biology) môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay tượng sinh vật mức độ phân tử Mục đích sinh học phân tử tìm hiểu mối tương tác hệ thống khác tế bào bao gồm mối liên hệ tương tác phân tử DNA, RNA, trình tổng hợp protein tìm hiểu chế điều hòa mối tương tác Kiến thức mối tương tác đối tượng tế bào, mô, quan, hệ quan, thể v.v giúp ta tìm hiểu sâu học thuyết trung tâm (central Dogma) di truyền học từ có can thiệp thích hợp để đưa đến ứng dụng y dược học, nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi sinh.v.v Sinh học phân tử không giúp người nghiên cứu hình thái sinh vật mức độ tinh vi mà nghiên cứu trình hình thành, phát triển (về số lượng kích thước) tế bào, quan, cá thể hay loài nghiên cứu chức q trình II.1.2 Các phương pháp nghiên cứu Sinh học phân tử II.1.2.1 Phương pháp PCR (Polymerase chain Reaction) II.1.2.1.1 Nguyên tắc: Tất ADN – polymerase tiến hành tổng hợp đoạn ADN cần có mạch khn ADN đoạn mồi Mồi đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn ADN – polymerase làm nhiệm vụ nối dài mồi để hình thành mạch Phương pháp PCR dựa vào đặc tính hoạt động ADN – polymerase Khi cung cấp mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với đầu ADN ta tổng hợp đoạn ADN nằm mồi * PCR thực qua ba bước: -5- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh - Bước 1: Biến tính phân tử ADN khn: Để gây biến tính ADN, chuyển ADN mạch kép thành ADN mạch đơn, cần sử dụng nhiệt độ cao nhiệt độ Tm phân tử, thường khoảng 92 – 950C thời gian khoảng phút - Bước 2: Mồi bắt cặp với khn: Q trình xảy nhiệt độ tháp Tm (40 – 700C) khoảng phút - Bước 3: Nhờ ADN – poymerase, trình tổng hợp chuỗi ADN xảy Qua strinhf thực nhiệt độ cao, khoảng 72 0C, nhờ sử dụng ADN – polymerase chịu nhiệt: Tap-polymerase Ba giai đoạn xảy theo chu kì lặp lại nhiều lần làm cho sau lần, số lượng mẫu tăng lên gấp đơi, q trình khuếch đại mẫu theo cấp số nhân, sau khoảng 30 chu kỳ tạo 106 mẫu ban đầu II.1.2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR: - ADN mẫu : Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy với ADN thật tinh - Enzim: Enzim sử dụng enzim polymerase chịu nhiệt tách từ vi khuẩn suối nước nóng - Mồi - primer: Tức đoạn DNA đơn có kích thước vài chục base, bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào đoạn khởi đầu đoạn kết thúc chuỗi DNA đích chuỗi đích biến tính thành sợi đan + Đoạn mồi có hai vai trị : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu thử nghiệm -6- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh (2) Khởi động men polymerase men polymerase bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích nhận dạng đầu 3', tình trạng sợi đơi - Nhiệt độ (Tm): + Công thức sử dụng điều kiện primer có khoảng 20 oligo nucleotit Td = 4(G+C)+2(A+T) A, T, G, C số lượng nucleotit oligo nucleotit - Dung dịch đệm: Thường chứa muối đệm Tris HCL 10 mM, KCL 50Mm MgCl2 1.5mM Ngoài dung dịch đệm PCR cịn chứa 0.001% BSA hay Gelatine số phản ứng PCR cịn thêm tween hay formamide Ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nồng độ MgCl2, để có thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phả ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng cách thăm dị nồng độ MgCl2 thích hợp - Số lượng chu kỳ: Trong thực tế người ta thưởng sử dụng 30 chu kỳ tối ưu không vượt 40 chu kỳ Sở dĩ phản ứng PCR diễn qua giai đoạn: + Giai đoạn đầu: có số lượng tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu + Giai đoạn sau: Số lượng giảm dần phân hủy làm cạn kiệt thành phần tham gia phản ứng, xuất sản phẩm phụ vừa tạo không kết hợp với mồi mà kết hợp với Số chu kỳ cho phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu Ví dụ số lượng mẫu 105 cần 25 – 30 chu kỳ; số lượng mẫu 10 – 103 số chu kỳ phải 35 – 40 chu kỳ II.1.2.1.3 Qui trình tiến hành PCR: -7- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phương pháp PCR Quá trình thực phương pháp PCR xảy theo chu với bước sau : - Bước 1: Biến tính phân tử ADN khn tiến hành 94 0C Trước hết tiến hành xử lý mẫu 940C phút đầu để khởi đầu q trình Sau đầu chu kỳ lại xử lý 940C 30 phút để biến tính ADN - Bước : -8- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Kết hợp mồi vào khuôn cho mồi vào với mẫu ADN biến tính xử lý nhiệt độ 600C 30 phút, nhiệt độ primer srx liên kết với ADN khuôn - Bước : Tổng hợp chuỗi ADN Cho nguyên liệu dNTP vào xử llys nhiệt độ 72 0C phút, nhiệt độ trình tổng hợp chuỗi bổ sung cho chuỗi ADN khuôn xảy Sau kết thúc giai đoạn 3, tiếp tục quay lại chu kì với việc xử lý nhiệt độ 940C 30 giây Mọi thao tác tiến hành phịng vơ trùng Mẫu thu cất giữ 40C II.1.2.2 Phương pháp tách chiết axit nucleic II.1.2.2.1 Phương pháp tách chiết axit nucleic * Phương pháp tách chiết ADN: - Các bước + Phá bỏ màng tế bào màng nhân + Loại bỏ tạp chất + Kết tủa axit nucleic - Quy trình tách chiết -9- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Mẫu Cố định mẫu N2 lỏng Mẫu hoạt tính enzim Nghiền với hỗn hợp phenol-Tris SDS Hỗn hợp Lọc Dịch Bã (bỏ đi) 40C-24h, lọc Dịch Bã (bỏ đi) Alcol 960+Acetat Na1M -200C-24h Hỗn hợp Ly tâm 3000g/10' Tủa (Axit Nucleic tổng số) Dịch (bỏ đi) NaCl0,3M+Cetavlon 40C-30' Hỗn hợp Ly tâm 3000g/10' Tủa (ARN) Dịch (ADN) * Phương pháp tách chiết ARN: - Các bước: + Phá bỏ màng tế bào + Tách protein khỏi hỗn hợp xử lý phenol-chlorofform ly tâm - 10 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh phân bố chủng HP khác vùng địa lý khác chủng HP đặc biệt liên quan mật thiết đến tình trạng bệnh lý định - Các vi khuẩn khác Coxiella burnetti với mảnh 438-bp gen mã hoá cho protein 27kDa màng ngoài; Salmonella typhi với mảnh 343-bp mã hố cho protein lơng 599-bp mã hố cho kháng nguyên Vi; Pseudomonas pseudomallei (hay Burkholderia pseudomallei) với mảnh 517-bp 16S ARNr khuyếch đại thành công PCR - Xác định độc tố vi sinh vật: tiểu đơn vị A độc tố ruột không chịu nhiệt Escherichia coli, gần đây, gen elta elfB E.coli sinh độc tố ruột (Enterofoxigenic Escherichia Coli_ ETEC); vt1 vt2 E coli gây chảy máu đường ruột (Enterohemorrhagic Escherichia coli_EHEC); eaeA bfpA E côli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli_ EPEC); ial E.coli xâm nhập đường ruột (Enteroinvasive Escherichia coli_EIEC) Shigella khuyếch đại PCR nhằm chẩn đoán phân biệt loại Escherichia coli gây tiêu chảy - Xác định vi khuẩn ngồi mơi trường: vi khuẩn khó ni cấy / thường có mặt ngồi mơi trường tìm trực tiếp PCR, Legionella, Salmonella, Shigella Vibrio cholerae Nói tóm lại, dùng PCR để tìm tác nhân gây bệnh áp dụng rộng rãi PCR có lợi lớn nhanh (thời gian cần thiết cho chẩn đốn tính "giờ" so với kỹ thuật kinh điển phải tính "ngày"), nhạy (độ nhạy cao, cần từ 10 - 1000 tế bào vi khuẩn, tuỳ theo kỹ thuật, đủ) độ đặc hiệu cao Nhờ vậy, bệnh chẩn đốn nhanh xác Giá trị chẩn đoán bệnh PCR đặc biệt trường hợp vi sinh vật không nuôi cấy nuôi cấy khó khǎn, tốn kém; kết ni cấy chậm, bệnh nhân dùng kháng sinh trước vào viện, PCR khơng thiết địi hỏi phải có vi sinh vật sống Tuy vậy, nay, điểm hạn chế (như địi hỏi phải có trang thiết bị nguyên vật liệu - 23 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh riêng, đắt tiền; cán kỹ thuật phải có trình độ định; kỹ thuật thực phức tạp), PCR bổ sung không thay hẳn phương pháp chẩn đoán kinh điển khác (2) PCR đa mồi (multiplex-PCR) chẩn đoán phân tử xác định phân biệt ký sinh trùng Đối với ký sinh trùng, có hàng chục phương pháp kit chẩn đốn multiplex-PCR sử dụng phát nhiều loài gây bệnh Khi ký sinh trùng tồn vị trí, vùng quan thể (ví dụ: máu, đường ruột/khoang ruột, phổi/dịch phổi, metacercariae vật chủ trung gian), việc lúc phát phân biệt nhiều loài gây bệnh mang lại tính kinh tế lợi ích cao nhiều so với thực đơn lẻ (Edwards, Gibbs, 1994; De Lellis et al., 2008) MultiplexPCR xây dựng để ứng dụng chẩn đốn phân biệt lồi sán lá/sán dây, bao gồm sán gan nhỏ Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini (Le et al., 2006); sán gan lớn F hepatica từ ốc vật chủ trung gian (Magalhães et al., 2004; 2008); sán phổi Paragonimus spp (Sugiyama et al., 2006; Le et al., 2006); sán dây Taenia saginata, Taenia solium, Taenia saginata asiatica ấu trùng sán lợn (González et al., 2000; 2004; Yamasaki et al., 2004; Trachsel et al., 2007); sán chó Echinococcus multilocularis (Davidson et al., 2009) Multiplex-PCR sử dụng phát phân biệt loại giun trịn (nematode) có Trichinella nematode đường ruột (Zarlenga et al., 1999; 2001a,b); phân biệt Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Oesophagostomum bifurcum (Verweij et al., 2007) loài Oesophagostomum spp lợn (Lin et al., 2008); phát phân biệt Brugia malayi Wuchereria bancrofti với (Mishra et al., 2007) với ký sinh trùng sốt rét (Rao et al., 2009); Multiplex-PCR tỏ sử dụng hữu hiệu chẩn đoán phân biệt nhiều nhóm ký sinh trùng đơn bào (protozoa), chủ yếu tập trung vào nhóm ký sinh trùng đơn bào đường ruột Cryptosporidium Giardia (Patel et al., 1999; Gile et al., 2002; - 24 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Guy et al., 2003); Cyclospora Eimeria (Orlandi et al., 2003; Fernandez et al., 2003); đặc biệt ký sinh trùng đơn bào máu, chủ yếu tập trung ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp, trước hết phân biệt loài gây bệnh, chủ yếu người, Plasmodium falciparum, P vivax, P malariae, P ovale, theo nhóm loại từ máu (Padley et al., 2003; Patsoula et al., 2003; Rougemont et al., 2004; Veiga et al., 2006; Rao et al., 2009); từ vector muỗi Anopheles (Lardeux et al., 2008) Một loại ký sinh trùng khác thường có máu Leishmania spp chẩn đoán phân biệt multiplex-PCR từ máu, da hay từ nguồn truyền lây vector loài muỗi cát Lutzomyia (Harris et al., 1999; Jorquera et al., 2005; Rodríguez-González et al., 2007; de Pita-Pereira et al., 2008) hayký sinh trùng đường máu lê dạng trùngBabesia caballi Babesia equi động vật (Alhassan et al., 2005) loài đơn bào máu khác phát multiplex-PCR có Toxoplasma gondii (Ajzenberg et al., 2005; Nowakowska et al., 2006) Multiplex-PCR cịn ứng dụng chẩn đốn lỵ amíp khả phát nhanh, xác phân biệt lồi gây bệnh với nhiều lồi khác có hình thái tương tự, trước hết Entamoeba histolytica Entamoeba dispar từ phân người bệnh (Evangelopoulos et al., 2000; Haque et al., 2007; Khairnar, Parija, 2007) Về vùng gen đích chọn lựa sử dụng chẩn đốn, nhiều tác giả khai thác hệ gen nhân tế bào hướng tới đối tượng gen 18S rRNA phân biệt cầu trùng Eimeriavới Cyclospora(Orlandi et al., 2003), giám định phân biệt loài Cryptosporidium (Patel et al., 1999), phát loài ký sinh trùng sốt rét Plasmodium (Rougemont et al., 2004); hay đối tượng gen pfcrt, pfmdr1, pfdhfr ký sinh trùng sốt rét (Veiga et al., 2006) nhiều vùng gen hay vùng giao gen khác Nhiều công trìnhkhai thác đích hệ gen ty thể (mitochondrial genome), ví dụ chẩn đốn phân biệt sán dây Taenia spp (Trachsel et al., 2007; Yamasaki et al., 2004; 2006); sán gan nhỏ Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini (Le et al., 2006); sán - 25 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh gan lớn Fasciola hepatica (Magalhães et al., 2004; 2008); phân biệt định loài động vật thức ăn thực phẩm (Ono et al., 2007) Hướng sử dụng hệ gen ty thể nghiên cứu chẩn đốn lồi kể ứng dụng multiplex-PCR coi có sở vững vàng điều kiện Do có kích thước nhỏ, tồn nhiều tế bào (vài trăm/tế bào), cấu trúc vịng DNA khép kín nên bền vững, cấu trúc đơn gen liên tục thuận lợi cho PCR hoạt động, tế bào cho nguồn khuôn DNA gấp hàng trăm lần so với hệ gen nhân nên phản ứng PCR có độ nhạy cao (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006) Điều có ý nghĩa sử dụng tế bào trứng giun sán làm nguồn khuôn cho multiplexPCR, cần tế bào trứng cho hàng trăm phân tử DNA hệ gen ty thể Nhiều cơng trình thiết kế multiplex-PCR sử dụng trứng giun/sán cung cấp nguồn khuôn DNA để tận dụng tính đơn giản thu mẫu (chỉ cần phân người bệnh, nhiều ký sinh trùng phủ tạng đường ruột; hay đờm chất dịch hô hấp, sán phổi) (Trachsel et al., 2007; Davidson et al., 2008) Gen/hệ gen ty thể nhiều loài ký sinh trùng giải mã đăng ký Ngân hàng gen giới, tạo sở liệu để truy cập ứng dụng việc thiết kế mồi đặc hiệu loài cho multiplex-PCR so sánh phân biệt chẩn đoán, giám định phân loại (Le et al., 2002; Hu, Gasser, 2006) Có hàng ngàn hệ gen ty thể giải trình tự phân tích hồn tồn, hàng trăm hệ gen ty thể khác phần giải quyết, bao gồm tất loài quan trọng từ bậc thấp đến bậc cao, từ động vật đơn bào đến động vật đa bào, cung cấp hệ thống liệu quan trọng cho trình nghiên cứu gen, protein, tiến hoá, lịch sử tiến hoá, di truyền quần thể, quan hệ loài, giống nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan trọng khác, có sử dụng liệu để thiết kế mồi cho multiplex PCR Ngồi cịn sử dụng gen đích hệ gen nhân chiến lược thiết kế phương pháp PCR đa gen/đa mồi để chẩn đoán phân biệt (3) Nghiên cứu ứng dụng PCR đa mồi xác định phân biệt ký sinh trùng Việt Nam - 26 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Nghiên cứu sinh học phân tử giám định thành phần lồi chẩn đốn phân biệt lồi giun/sán Việt Nam kỹ thuật PCR sử dụng thị di truyền hệ gen ty thể số tác giả thực có hiệu quả, đặc biệt 10 năm gần Có hàng trăm cơng trình sử dụng PCR đa mồi chẩn đoán phân biệt ký sinh trùng đăng tải phản ánh định hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật cao lĩnh vực ký sinh trùng, mà chúng tơi khơng có ý định nêu hết tổng quan này, điểm qua số kết nhóm chúng tơi thực Trước hết, nghiên cứu xác định lồi sán dây châu Á Taenia asiatica Việt Nam (Lê Thanh Hòa cs, 2002; Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hồ, 2006) Sau lồi sán khác thẩm định thành phần loài như: sán gan nhỏ C sinensis, sán ruột Fasciolopsis buski, sán gan lớn Fasciola gigantica, sán phổiParagonimus heterotremus, P vietnamensis, P proliferus (Le cs, 2006; Doanh cs, 2007; 2008; 2009); sán dây T saginata, T solium ký sinh người, ấu trùng sán dây lợn lợn người thẩm định sinh học phân tử hệ gen ty thể (Lê Thanh Hoà cs, 2002; Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà, 2006) số chuỗi gen đăng ký Ngân hàng Gen giới Những kết bước đầu góp phần giải số vấn đề xác định thành phần loài giun sán Việt Nam làm sở khoa học cho việc nghiên cứu kit multiplex PCR để chẩn đốn xác định bệnh giun sán Đồng thời sở liệu quý báu cho khoa học nghiên cứu đa dạng sinh học đóng góp vào hoạch định chiến lược phịng chống giun sán có hiệu Việt Nam Cho đến nay, nghiên cứu sinh học phân tử chẩn đoán ký sinh trùng thực góc độ đơn lồi, kit PCR đơn gen, mà chưa có định hướng tổng thể sàng lọc, xây dựng kit đa gen (multiplex-PCR) cho nhóm lồi, hay cho hỗn hợp lồi tồn người vị trí phân bố cần chẩn đốn (Lê Thanh Hồ, 2007) Tuỳ theo khu trú hỗn hợp loài ký sinh trùng gây bệnh, chúng tơi mong muốn chọn lọc phân nhóm loài đối tượng, hoặc/và phân - 27 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh vùng khu trú (ruột, lấy mẫu phân; phổi, lấy mẫu đờm, dịch tiết phổi), xây dựng kit song gen (duplex-PCR), đa gen (multiplex-PCR) để chẩn đoán sàng lọc giám định định hướng xun suốt chiến lược xây dựng phương thức kit chẩn đoán sinh học phân tử nước ta Do vậy, việc nghiên cứu chẩn đoán phân tử thiết, đặc biệt nghiên cứu kit PCR đa gen/đa mồi (multiplex-PCR) ký sinh trùng mà chúng tơi xây dựng giúp cho việc chẩn đốn hồn tồn xác góp phần to lớn phịng chống bệnh có hiệu phạm vi nước (Lê Thanh Hòa, 2009) Gần đây, phương pháp nhân DNA phát triển giới thiệu ứng dụng, gọi phương pháp LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) tạo sản phẩm DNA mạch vịm, nhìn thấy mắt thường để đánh giá kết (Notomi et al., 2000; Mori, Notomi, 2009) Trong vòng 10 năm qua kể từ giới thiệu, LAMP thu hút quan tâm nhà nghiên cứu xét nghiệm sở tác nhân gây bệnh, tính xác, đơn giản, hiệu suất, giá thành thấp dễ thực đánh giá LAMP phát triển thành sinh phẩm (kit) thương mại phổ biến rộng rãi toàn giới Đến nay, có 350 cơng trình thực LAMP, ứng dụng hầu hết loài (vi) sinh vật, ký sinh trùng gây bệnh người động vật Cùng tính đặc hiệu tính nhạy PCR, LAMP thực sử dụng phương pháp chẩn đoán tiên tiến với đối tượng trở nên cạnh tranh đắc lực với PCR, tính nhanh chóng dễ làm, dễ đánh giá khơng tốn nguyên vật liệu bệnh phẩm (Nagamine et al., 2002; Parida, 2008; Mori, Notomi, 2009) Vậy phương pháp LAMP gì? LAMP, tạm gọi tổng hợp DNA-vịm (hay vắn tắt kỹ thuật/phương pháp DNA-vòm) phát triển năm 2000, phương pháp tổng hợp DNA mồi đặc hiệu nhận biết vùng khác biệt gen đích từ nguồn khn nhất, tạo nên dạng sản phẩm DNA có cấu trúc vịm (stem-loop structure), hiển thị dạng hỗn hợp vẩn đục màu trắng, nên dễ dàng phát mắt thường; cho thêm chất huỳnh quang, sản phẩm phát - 28 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh quang dễ nhận biết (Notomi et al., 2000; Parida et al., 2008) Dạng vẩn đục màu trắng Magnesium pyrophosphate (Mg2P2O7) sản phẩm phụ phản ứng sinh trình tạo DNA mạch vòm dễ quan sát đánh giá kết (Mori et al., 2001) Phương pháp DNA-vịm khơng địi hỏi điều kiện phịng thí nghiệm đại, nhân lực trình độ cao, phản ứng xảy đặc hiệu, thực nhanh chóng (Mori, Notomi, 2009), thích hợp cho chẩn đốn phân tử virus, vi khuẩn ký sinh trùng gây bệnh nước phát triển vùng nhiệt đới (Dong et al., 2008; Parida, 2008) Nếu PCR/RT-PCR, bao gồm multiplex-PCR, cho sản phẩm đặc hiệu DNA mạch thẳng thuận lợi cho phương pháp sinh học phân tử phân tích đặc tính gen/hệ gen sau tách dịng giải trình tự (Powledge, 2004; Ishmael, Stellato, 2008); LAMP/RT-LAMP cho sản phẩm đặc hiệu DNA bắt cặp chuỗi lại với tạo mạch vịm khơng thuận lợi cho tách dịng xem xét thành phần gen/hệ gen, DNA-vịm có lợi to lớn sản phẩm hiển thị dạng vẩn đục trắng sản sinh muối pyrophosphate (Mg 2P2O7) với chất phát quang nhìn thấy mắt thường, phục vụ nhanh chóng cho chẩn đốn (Mori et al., 2001;Goto et al., 2009) (Hình 3) Trong trường hợp LAMP sử dụng làm kit chẩn đoán, người ta thường thiết kế thêm cặp mồi đặc hiệu bám vào hai đầu biên vùng gen đích để thực phản ứng PCR/RT-PCR, thu sản phẩm DNAthẳng, tách dòng, giải trình tự để kiểm nghiệm tính đặc hiệu cho chắn (Parida, 2008) Phương pháp kiểm tra giả nghiệm thực với nguồn khuôn khác (vi) sinh vật giống (genus) để đảm bảo chắn tính xác đặc hiệu kit chẩn đoán LAMP (Parida, 2008; Parida et al., 2008) Kể từ giới thiệu từ năm 2000, ngày có nhiều nghiên cứu đưa LAMP vào ứng dụng chẩn đốn lĩnh vực khác nhau, có ký sinh trùng Đối với ký sinh trùng, nhiều chúng tồn vị trí nên dễ lấy bệnh phẩm, nhiên việc phân biệt chẩn đốn xác nhận có mặt - 29 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh lồi gây bệnh khơng dễ dàng sử dụng phương pháp hình thái học Việc phát đặc hiệu loài gây bệnh để phân biệt nhiều lồi khác nhanh tốt có ý nghĩa lớn chẩn đoán, vậy, LAMP trở nên công cụ hữu hiệu xác định nhanh đối tượng số đông tồn (Criado-Fornelio, 2007; Adams, Hamilton, 2008) Trong 10 năm qua, bên cạnh việc thăm dò phương pháp xây dựng kit với tiêu chuẩn chẩn đoán sau khảo nghiệm, LAMP ứng dụng thực tế với nhiều loại ký sinh trùng khcá gây bệnh động vật người LAMP xây dựng để ứng dụng chẩn đoán phân biệt loại ký sinh trùng đơn bào, trước hết lồi Trypanosoma spp gây bệnh châu Phi (Kuboki et al., 2003; Adams, Hamilton, 2008; Thekisoe et al., 2009), bao gồm chẩn đốn phân biệt lồi phân giống Trypanozoon (Njiru et al., 2009) xác xác định loài Trypanosoma brucei rhodesiense (Njiru et al., 2008) LAMP thăm dị chẩn đốn ký sinh trùng đường máu động vật Trypanosoma evansi qua kiểm tra lợn thực nghiệm (Thekisoe et al., 2005; 2007) Một số loại ký sinh trùng đường máu khác ứng dụng LAMP để chẩn đốn có lê dạng trùng Babesia orientalisgây bệnh trâu Trung Quốc (He et al., 2009) hay phát loài Babesia gibsoni Nhật Bản (Ikadai et al., 2004); phân biệt loài giống Babesia (Guan et al., 2008) hay loài piroplasma bao gồm Babesia spp Theileria spp gây bệnh bò (Criado-Fornelio, 2007; Thekisoe et al., 2007; Liu et al., 2008; Salih et al., 2008), đặc biệt lồi Theileria parva gây bệnh bị (Thekisoe et al., 2010) Đối với Leishmania donovani, Takagi et al (2009), phương pháp LAMP chẩn đoán nhạy cần fg khuôn DNA đủ phát phân biệt với loài Leishmania spp (L infantum, L major, L mexicana, L tropica, L braziliensis) khác Phương pháp LAMP phát ký sinh trùng đơn bào đường máu Toxoplasma gondii từ đất; loài đơn bào gây bệnh sang người số nhà nghiên cứu lấy làm - 30 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh đối tượng xây dựng thành kit chẩn đoán người (Sotiriadou, Karanis, 2008; Krasteva et al., 2009; Zhang et al., 2009) Đơn bào gây bệnh người động vật truyền qua thức ăn nước uống thuộc giống Cryptosporidium Giardia đặc biệt quan tâm sử dụng LAMP tính nhạy phương pháp (Bakheit et al., 2009), trước hết chẩn đoán Cryptosporidium spp Giardia duodenalis nước uống (Inomata et al., 2009; Plutzer, Tomor, 2009; Karanis, 2010) động vật truyền lây (Plutzer, Tomor, 2009), phân thải mơi trường (Karanis et al., 2007) Bên cạnh lỵ amíp Acanthamoeba (Lek-Uthai et al., 2009) hay Entamoeba histolytica (Liang et al., 2009) đối tượng phương pháp chân đốn Một ứng dụng có hiệu sử dụng LAMP phát triện phương pháp chẩn đốn phân biệt lồi ký sinh trùng sốt rét Plasmodium spp (Han et al., 2007; Aonuma et al., 2008) đơn lẻ loài Plasmodium falciparum (Poon et al., 2005; Yamamura et al., 2009) Plasmodium vivax (Chen et al., 2010) Đối với giun tròn, có cơng trình nghiên cứu xây dựng phương pháp LAMP chẩn đoán giun Dirofilaria immitis từ vector muỗi (Aonuma et al., 2009); sán dẹt, có lồi sán máng Schistosoma japonicum (Xu et al., 2010) loài sán dây Taenia spp (Nkouawa et al., 2009) làm đối tượng LAMP Giun tròn sán dẹt gây bệnh truyền từ động vật sang người cịn có nhiều lồi nguy hiểm khác cần xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh LAMP * Định loại vi khuẩn: Sau phân lập vi khuẩn, PCR góp phần quan trọng định loại chúng - Đối với vi khuẩn cụ thể, qui trình cho PCR với bệnh phẩm từ lâm sàng thường giống với bệnh phẩm vi khuẩn Tuy vậy, việc chuẩn bị ADN mẫu (template) từ vi khuẩn cho PCR đơn giản: cần đun sôi cách thuỷ - 31 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh huyền dịch vi khuẩn 10 phút thu lấy dịch sau ly tâm loại bỏ tế bào đủ - Nhờ khuyếch đại đoạn gen phụ trách ARNr 16S, người ta so sánh mối quan hệ gần gũi hay xa vi khuẩn, góp phần phân loại vi khuẩn chi tiết xác * Đơn bào Amíp - Dùng PCR để tìm đoạn gen mã hố cho protein 30.000 Mdal liên quan tới độc tính Entamoeba histolytica, người ta phân biệt amíp gây bệnh amíp khơng gây bệnh; - PCR phát tác nhân Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii phân từ Sydney, Úc nhóm nhà nghiên cứu R Fotedar, D Stark, N Beebe, D Marriott, J Ellis, J Harkness công tác khoa vi trùng, bệnh viện St Vincent's, Sydney, Australia, Viện Công nghệ sinh học bệnh truyền nhiễm, đại học Kỹ thuật Sydney, Broadway, Australia, Khoa khoa học sinh học y học, đại học Sydney, Broadway, Australia tiến hành cho biết nghiên cứu họ nhằm tiến hành xem xét có mặt Entamoeba histolytica, Entamoeba dispar, Entamoeba moshkovskii mẫu phân tren bệnh nhân Sydney, Australia Các mẫu phân xét nghiệm kính hiển vi PCR bệnh nhân tìm thấy E histolytica, E dispar E moshkovskii tìm thấy 63 (70.8%) 55 (61.8%) bệnh nhân PCR Đây nghiên cứu Australia sử dụng kỹ thuật phân tử để xác định có mặt E histolytica, E dispar, E moshkovskii; - Phân biệt Entamoeba histolytica / Entamoeba dispar kỹ thuật PCR liên uqan đến miễn dịch tế bào miễn dịch dịch thể cá nhân có triệu chứng lâm sàng nhiễm a míp khác Đây cơng trình nghiên cứu nhóm tác giả Sánchez-Guillén Mdel C, Pérez - Fuentes R, Salgado - Rosas H, Ruiz Argüelles A, Ackers J, Shire A, Talamas-Rohana P làm việc khoa ký sinh trùng, trung tâm y sinh học Oriente, IMSS, Puebla, México Kết cho biết họ - 32 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh sử dụng kỹ thuật colorimetric PCR để phân biệt E histolytica với E dispar cá nhân nhiễm bệnh amip liên quan đến liệu lâm sàng đáp ứng miễn dịch dịch thể miễn dịch qua trung gian tế bào với amip Kết nồng đọ kháng thể cao nhiễm amip cấp tăng sinh IL-4 , loại cytokine liên quan đến Th2, liên quan E histolytica Trong bệnh amip mạn tính, huyết chống amip dương tính, triệu chứng tiêu hóa liên quan đến E dispar tất bênh nhân, khác biệt mức độ kháng thể BTI, CD4+/CD8+, INF-gamma, IL-4 Trong số người mang trùng không triệu chứng, E dispar trường tìm thấy Tuy nhiên, việc xác định E histolytica người mang trùng không triệu chứng liên quan với nồng độ INF-gamma cao, loại cytokine liên quan đến Th1, tầm quan trọng chẩn đoán đặc hiệu cho Entamoeba spp., để thiết lập đặc ddiemr lâm sàng dịch tễ học amip đường ruột amip ruột - Ứng dụng kỹ thuật Real-Time-PCR chẩn đốn Entamoeba histolytica nhóm tác giả Shantanu Roy, Mamun Kabir, Dinesh Mondal, Ibne Karim M Ali, William A Petri Jr vaf Rashidul Haque thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh tiêu chảy quốc tế, Bangladesh (ICDDR,B), Dhaka, Bangladesh, Đại học y tế nhiệt đới Vệ sinh London, Anh, khoa y, vi sinh bệnh học đại học Virginia, Charlottesville, Virginia nghiên cứu cho biết họ triển khai kỹ thuật real- 33 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh time-PCR sử dụng đầu dò beacon probe phân tử để phát Entamoeba histolytica so sánh độ nhạu với kỹ thuật xét nghiệm phát kháng nguyên phân với kỹ thuật PCR cổ điển Tổng số 205 mẫu phân mẫu mủ abces gan bệnh nhân làm nhóm chứng nghiên cứu này, 101 (49%) dương tính kỹ thuật phát kháng nguyên đặc hiệu E histolytica, 104 (51%) trường hợp mẫu phân khác mủ âm tinh với kỹ thuật phát kháng nguyên DNA tách chiết từ phân mủ ổ abces theo phương pháp hãng QIAGEN small-subunit rRNA gene E histolytica, khuyêch đại kinh điển làm theo real-time PCR Trong số 205 mẫu phân mủ từ ổ abces, có đến 124 mẫu dương tính kỹ thuật real-time-PCR 90 mẫu dương tính PCR cổ điển So sánh với real-time-PCR, kỹ thuật phát kháng nguyên có độ nhạy 79% độ đặc hiệu 96% Khi dùng kỹ thuật PCR kinh điển so với real-timePCR, độ nhạy PCR kinh điển 72% độ đặc hiệu 99% Kết cho thấy phương pháp phát E histolytica có độ đặc hiệu cao kỹ thuật real-time PCR cho độ nhạy cao - Một nghiên cứu khác tiến hành nhằm so sánh kỹ thuật PCR với phương pháp phát kháng ngun để chẩn đốn Entamoeba histolytica nhóm tác giả S J Furrows, A H Moody, P L Chiodini thuộc khoa vi trùng, Cecil Fleming House, đại học London, Grafton Way, London WC1H, Anh tiến hànhtheo phương pháp ELISA PCR - SHELA (, polymerase chain reaction solution hybridisation enzyme linked immunoassay) so sánh 101 mẫu phân Kết cho thấy 15/101 mẫu phân dương tính vớiE histolytica hay nhiều phương pháp Sự trái ngược kết phương pháp 5/15 mẫu * Virus -Vi rút viêm gan B, HIV, vi rút thuỷ đậu, vi rút Herpes simplex, Papillomavirus, Cytomegavirus Enterovirus chẩn đốn thành cơng PCR Đối với HIV, tài liệu dẫn cho thấy, PCR cho kết dương tính sớm dấu hiệu biến đổi miễn dịch từ - tháng; đặc biệt cho phép - 34 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh chẩn đoán HIV trẻ sơ sinh, mà kháng thể kháng HIV trẻ lúc này, có thể, đơn từ mẹ truyền sang -PCR khuyếch đại gen nói thay bổ sung cho thử nghiệm kinh điển có độ nhậy độ đặc hiệu thay cho kỹ thuật phức tạp -Độc tố ruột vi khuẩn tả (CT), (CT, cholera toxin) đóng vai trị chủ đạo chế gây bệnh chúng PCR dùng khuyếch đại đoạn gen mã hoá cho CT; nhờ đó, phân biệt cách chắn Vibrio cholerae gây bệnh tả thực với Vibrio cholerae khác, thuộc nhóm huyết khơng gây bệnh tả (trước gọi Vibrio không ngưng kết; nonagglutination, NAG) - Clostridium difficile định loại thông qua xác định loại độc tố riêng biệt chúng PCR - 35 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ III.1 Kết luận Sinh học phân tử phát triển có đóng góp to lớn đảm bảo cho chất lượng sống người Nó tạo bước tiến dài y học thời gian ngắn, phục vụ cơng tác chăm sóc sức khỏe cho người Sinh học phân tử đã ứng dụng rộng rãi có hiệu nhiều mặt y học, từ việc xét nghiệm ADN, xác định huyết thống dấu ấn di truyền, chẩn đoán ADN bệnh lý để phát bệnh di truyền, đưa phác đồ điều trị hợp lý, ứng dụng để chữa trị bệnh tật cụ thể liệu pháp gen Khơng dừng lại đó, Sinh học phân tử được tiếp tục nghiên cứu, thử nghiệm mở nhiều triển vọng khả chữa trị số bệnh hiểm nghèo thời gian không xa bệnh Hemophilia (Rối loạn máu di truyền), Ung thư Muscular Dystrophy (Chứng loạn dưỡng cơ) Với tốc độ phát triển khoa học công nghệ nói chung Sinh học phân tử nói riêng, hồn tồn tin tưởng vào thời đại công nghệ Sinh học phân tử tương lai, Y học ứng dụng thành tựu Sinh học phân tử vào việc chữa bệnh chăm sóc sức khỏe người, chẩn đốn xác điều trị hiệu bệnh mà tốn khó tồn nhân loại III.2 Đề nghị Những ứng dụng Sinh học phân tử tìm hiểu tiểu luận sơ lược, chưa đầy đủ nhiều thiếu sót Trên sở này, bổ sung phát triển đề tài ứng dụng Sinh học phân tử vào chủ đề đề cụ thể Y học để có thơng tin nhìn tồn diện vai trị to lớn Sinh học phân tử Y học - 36 - GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: Nguyễn Thị Thanh Vinh Phần IV: TÀI LIỆU THAM KHẢO PGS.TS Nguyễn Bá Lộc, Bài giảng Sinh Học Phân Tử (Dành cho học viên Cao học ngành sinh học), Huế, 2002 Hoàng Trọng Phán, Di truyền học phân tử, Huế, 1995 http://www.tintuccaonien.com/docs/docs_7/7_1_242.htm 4.http://www.scumdoctor.com/Vietnamese/disease-prevention/geneticdisorders/gene-therapy/Gene-Therapy-Hazards-And-Benifits.html 5.http://www.vsmmb.com/data/upload_file/File/PCR%20book %202/PCR_hoidapVGSV.pdf http://docx.vn/tai-lieu/51609/PCR-va-dau-van-tay-DNA.tailieu 7.http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/ung-dung-sinh-hoc-phan-tu-trong-chan-doanviem-gan-virus-c.787428.html - 37 - ... NỘI DUNG II.1 Sinh học phân tử II.1.1 Khái niệm Sinh học phân tử (molecular biology) môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay tượng sinh vật mức độ phân tử Mục đích sinh học phân tử tìm hiểu mối... Nhiều bệnh hiểm nghèo chặn ? ?ứng, nhiều bệnh khác có triển vọng tìm cách điều trị, … Tất điều đạt nhờ ứng dụng ngành Sinh học phân tử vào y học Sinh học phân tử môn khoa học nghiên cứu giới sinh. .. mang tính thời nên em chọn đề tài ? ?Ứng dụng Sinh học phân tử chẩn đoán bệnh? ?? với mong muốn mở mang kiến thức môn học Sinh học phân tử cập nhật thành tựu y học -4- GVHD: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc HVTH: