Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 1 Phần 1: GIỚI THIỆU CHUNG 1. ðỊNH NGHĨA VỀ PROBIOTIC: Probiotic ñược ñịnh nghĩa khác nhau bởi nhiều nhà nghiên cứu. ðịnh nghĩa về probiotic ñang ñược thay ñổi cùng với sự gia tăng kiến thức về chức năng của probiotic. Probiotic ñược ñịnh nghĩa là một canh trường vi sinh vật còn sống ñược phát triển trong miệng và sống sót khi di chuyển tới ruột già, nơi chúng ñịnh cư (Frost và Sullivan, 2000; Saarela và cộng sự, 2000; Matilla-Sandholm và cộng sự, 2002; Betoret và cộng sự, 2003). Schrezenmeir và de Vrese (2001) ñịnh nghĩa thuật ngữ probiotic như là một chế phẩm chứa những vi sinh vật xác ñịnh còn sống với số lượng lớn có khả năng thay thế vi sinh vật ñường ruột bằng cách ñịnh cư trong ruột của vật chủ và ảnh hưởng có lợi ñến sức khỏe vật chủ. FAO/WHO, 2001, chấp nhận ñịnh nghĩa về probiotic như sau: “vi sinh vật còn sống tồn tại với số lượng vừa ñủ và ảnh hưởng tốt ñến sức khỏe của vật chủ” (Leahy và cộng sự, 2005). Thực phẩm probiotic trở nên phổ biến nhờ vào ảnh hưởng tốt của chúng tới sức khỏe con người (Desmond và cộng sự, 2002). Trong liệu pháp probiotic, những vi sinh vật có lợi này ñược ñưa vào cơ thể qua ñường tiêu hóa và do ñó trở thành vi sinh vật ñường ruột. ðiều này dẫn tới kết quả là một số lượng lớn vi khuẩn có lợi ñã ñược khám phá và hạn chế những vi khuẩn gây hại (Mombelli và Gismondo, 2000). Ảnh hưởng có lợi của những vi khuẩn probiotic có ñược là do những vi sinh vật này bám chặt vào lớp biểu mô ruột (Sanminen và cộng sự, 1998). Sự hiện diện và bám chặt của probiotic vào lớp niêm mạc của thành ruột ñã tạo nên một rào chắn sinh học tự nhiên mạnh chống lại những vi khuẩn gây bệnh (Chen và Yao, 2002). Sự bám dính do ñó là bước ñầu tiên ñể ñịnh cư của chúng. Sự bám dính vào lớp biểu mô ruột rất rõ ràng bao gồm sự bám dính của vi khuẩn và phân tử nhận trên tế bào biểu mô hay không rõ ràng dựa trên những nhân tố hóa lý. Có nhiều giống vi khuẩn lactic có nguốc gốc từ sữa và cả từ người có khả năng bám dính hiệu quả vào tế bào người (Samninen và cộng sự, 1998). Một loài vi sinh vật xác ñịnh phải hội ñủ những ñặc ñiểm nhất ñịnh ñể ñược xem là một probiotic. Những ñặc ñiểm này phụ thuộc vào mục ñích sử dụng cũng như vị trí mà tại ñó những ñặc tính xác ñịnh ñược biểu thị. Những ñặc ñiểm quan trọng nhất của probiotic bao gồm (Havenaar và Huis int’Veld, 1992): − Sự sống sót của chúng trong ñiều kiện môi trường tại nơi chúng hoạt ñộng. − Sự sinh sôi và/hoặc sự ñịnh cư của chúng tại nơi hoạt ñộng. − Không có phản ứng miễn dịch chống lại probiotic từ cơ thể vật chủ. − Không gây bệnh, không ñộc, không gây dị ứng, không gây ñột biến hoặc các phản ứng gây ung thư sinh ra bởi bản thân giống probiotic, sản phẩm lên men hay do thành phần tế bào sau khi chết của tế bào. Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli 2 2. PHÂN BIỆT PROBIOTIC, PREBIOTIC VÀ SYNBIOTIC: Thông tin về probiotic ñã ñược chúng tôi cung cấp trên ñây. Tuy nhiên cũng có những thuật ngữ khác dễ gây nhầm lẫn ñó là prebiotic và symbiotic, sẽ ñược trình bày bên dưới. 2.1. Prebiotic: Prebiotic là những thành phần trong thức ăn không tiêu hóa ñược nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới con người bằng cách kích thích chọn lọc sự phát triển và/hoặc hoạt tính của một hay một số lượng giới hạn vi sinh vật nào ñó trong ruột kết (Roberfroid, 1998; Theuer và cộng sự, 1998; Young, 1998; Fermia và cộng sự, 2002). Chúng làm thay ñổi hệ vi sinh vật trong ruột, tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự phát triển của những vi khuẩn có khả năng tăng cường sức khỏe cho con người, ñặc biệt là Lactobacilli và Bifidobacteria, sao cho những vi khuẩn này chiếm ưu thế về số lượng (Roberfroid, 1998). ðiều này dẫn tới làm tăng cả số lượng vi khuẩn nội sinh trên trong phân (Fermia và cộng sự, 2002; Losada và Olleros, 2002). Prebiotic cũng ñiều hòa quá trình trao ñổi lipid thông qua quá trình lên men. Sự kích thích chọn lọc sự phát triển của Bifidobacteria bởi prebiotic ñược cho thấy sự giảm ñáng kể số lượng vi khuẩn có nguy cơ gây bệnh cho cơ thể (Losada và Olleros, 2002). Carbohydrate ñược sử dụng ñể tăng sự phát triển của những vi khuẩn có lợi. Những carbohydrate làm tăng sự phát triển của những vi khuẩn lactic ñược gọi là bifidogenic oligosaccharide (Farmer, 2002). Bifidogenic oligosaccharide chứa fructooligosaccharide (FOS) (inulin), glucooligosaccharide (GOS), những oligosaccharide mạch dài của fructose và/hoặc glucose và trisaccharide, raffinose. Chúng không dễ ñược tiêu hóa bởi những vi khuẩn gây bệnh (Annika và cộng sự, 2002; Farmer, 2002; Fermia và cộng sự, 2002). Những carbohydrate không tiêu hóa ñược tìm thấy trong nhiều loại trái cây, rau (artichoke, tỏi, tỏi tây và hành) và ngũ cốc (Fermia và cộng sự, 2002; Losada và Olleros, 2002). Chúng là một hỗn hợp các chuỗi ñường hình thành bởi các phân tử glucose và fructose. Sử dụng thực phẩm chứa prebiotic oligosaccharide vận chưa ñủ ñể hoàn thiện hệ vi sinh vật ñường ruột và chúng chỉ chiếm một thành phần nhỏ trong những thực phẩm trên. Thay vào ñó, prebiotic ñược khai thác từ những thực phẩm này và ñược cho vào những thực phẩm thông thường dễ dàng ñược tiêu hóa hơn như bánh biscuit hay những thực phẩm có nguồn gốc từ những carbohydrate khác (Taylor và cộng sự, 1999). Những thành phần tự nhiên này có thể ñược sản xuất rẻ tiền hơn bằng cách sử dụng enzyme β-D-fructofuranosidase hay fructosyltransferase ñể bổ sung thêm các phân tử fructose theo cơ chế chuyển gốc frutosyl (tranfructosylation). Những enzyme như α-amylase, saccharase và maltase không phân hủy ñược những oligosaccharide này, ñặc biệt là trong cơ thể con người (Losada và Olleros, 2002). Những nguyên liệu này tới ruột kết, nơi chúng có thể bị lên men hoàn toàn hay một phần hay vẫn chưa ñược lên men. Không có phân tử glucose hay fructose nào hình thành oligosaccharide hay inulin ngay tại tĩnh mạch cửa. Những nguyên liệu này ñược lên men bởi hệ vi sinh vật trong ruột kết. Quá trình lên men prebiotic dẫn tới sự kích thích chọn lọc sự phát triển của Bifidobacteria (Flamm và cộng sự, 2001). Trong ống Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 3 tiêu hóa (GI tract), bifidogenic oligosaccharide ñược chuyển hóa chỉ bởi vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacteria có sẵn trong ruột mà không phải bởi những vi sinh vật có hại như Clostridia, Staphylococcus, Salmonella và Escherichia coli. Sử dụng bifidogenic oligosaccharide cùng với vi khuẩn lactic tạo ra những ảnh hưởng tốt, vi khuẩn probiotic phát triển và cạnh tranh với những vi sinh vật gây bệnh không mong muốn trong ống tiêu hóa. Bifidogenic oligosaccharide làm tăng mức ñộ bổ sung dinh dưỡng và tăng ñộ hòa tan các chất dinh dưỡng (Farmer, 2002). Không giống như probiotic, prebiotic không phải là cơ thể sống và do ñó, chúng không có vấn ñề về sự sống sót trong sản phẩm và cả trong ruột (Frost và Sullivan, 2000). 2.1.1. Oligosaccharide không tiêu hóa ñược (NDO): Oligosacchride có trên thị trường ở dạng bột kết tinh hay sirup 75% (w/v).Sự chọn lựa oligosaccharide bị ảnh hưởng bởi vài nhân tố như chi phí, ảnh hưởng tới tính chất hóa lý của hực phẩm và ñộ bền của oligosaccharide trong ñiều kiện pH và nhiệt ñộ biến ñổi có thể làm thủy phân NDO. Những nhân tố khác có thể ñược xem xét như ảnh hưởng của NDO lên sinh lý và sức khỏe của con người. NDO có một số ảnh hưởng tới sinh lý của con người. Chúng ñược sử dụng như chất thay thế chất béo và ít năng lượng. Khả năng gây sâu răng thấp nên ngăn chặn ñược sự mài mòn của răng và xương và chúng cũng là một dạng của xơ ăn kiêng. Tuy nhiên nếu dùng với một lượng quá nhiều, chúng cũng gây ra một số triệu chứng như chướng bụng, ñầy hơi hay tiêu chảy. ðiều này xảy ra do có sự thay ñổi thế thẩm thấu hay do sự lên men quá nhiều. Những ảnh hưởng không mong muốn chỉ xảy ra khi sử dụng NDO quá liều (Holzapfel và Schillinger, 2002). 2.1.2. Fructooligosaccharide (FOS): FOS là oligosaccharide hình thành bởi 1 phân tử glucose liên kết với 1 – 3 phân tử fructose. Chúng là polymer mà các ñơn phân là β-D-fructosyl mạch ngắn gồm 9 ñơn phân (oligosaccharide) hay trung bình gồm 60 ñơn phân (inulin). FOS có trong các loài thực vật như hành, rễ măng tây, thân cây Jerusalem artichoke và lúa mạch. Ngoài ra còn có trong chuối, bia, cây ngưu bàng, hẹ, các cây graminae, mật ong, yến mạch, thông, lúa mạch ñen, rau diếp xoăn và ngay cả trong vi khuẩn và nấm men (Ziemer và Gibson, 1998; Bengmark và cộng sự, 2001). FOS mạch ngắn là một hỗn hợp oligosaccharide chứa glucose liên kết với fructose qua liên kết β-(1,2)-glucoside. Chúng không ñược tiêu háo hiệu quả trong ruột non người nhưng ñược lên men trong ruột kết nhờ hệ vi sinh vật ở ñây (Bounik và cộng sự, 1999). Những ñơn phân ñược nối với nhau bằng cầu nối ñặc biệt có thể chịu ñược sự tấn công của enzyme ñộng vật có vú (Ziemer và Gibson, 1998). Hầu hết các loài Bifidobacteria ñều có khả năng lên men ñược FOS. Bifidobacteria có hoạt tính enzyme β-fructosidase tương ñối cao ñặc hiệu cho liên kết β-(1,2)-glucoside có mặt trong FOS. Fructose, sản phẩm của quá trình thủy phân FOS, là nguồn cơ chất quan trọng cho quá trình lên men hầu như chỉ xảy ra với Bifidobacteria (Theuer và Cool, 1998). Chúng ảnh hưởng tốt lên cholesterol máu, triglyceride và áp suất máu ở những người lớn tuổi mắc bệnh tăng lipid máu (Bengmark và cộng sự, 2001). Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli 4 FOS ñại diện cho nguồn dinh dưỡng ñặc hiệu của những vi sinh vật có lợi và do ñó có tiềm năng ñể tăng sự hiệu quả của các sản phẩm probiotic hiện tại. Những nghiên cứu khoa học tại Nhật Bản cho thấy rằng sự tiêu thụ FOS thay ñổi sự cân bằng của hệ vi sinh vật ñường ruột theo chiều hướng gia tăng số lượng Bifidobacteria và các vi sinh vật có lợi khác ngay cả khi thiêu probiotic khi ăn kiêng (Losada và Olleros, 2002). Chúng ñược sản xuất trong công nghiệp bằng cách sử dụng 2 kỹ thuật sản xuất khác nhau nhưng thành phẩm lại không khác nhau nhiều. Trong phương pháp 1, FOS ñược tổng hợp từ nguyên liệu sucrose nhờ enzyme tranfructosylase còn trong phương pháp 2, inulin từ rau diếp xoăn ñược chuyển hóa. Polysaccharide sau ñó bị tác ñông bởi một enzyme thủy phân có kiểm soát (Frost và Sullivan, 2000). 2 FOS ñược sản xuất có cấu trúc tương tự nhau và có kích thước gần bằng nhau, do ñó chúng có sự khác nhau nhỏ trong chức năng là prebiotic. FOS ñược sử dụng an toàn và hiệu quả ñối với người và ñộng vật. Chúng không ảnh hưởng ñến AND, không có các chất gây ung thư và không có ñộc tính. FOS không chỉ ảnh hưởng tốt cho sức khỏe mà còn góp phần tạo nên kết cấu và hình dạng cho thực phẩm chứa chúng (Frost và Sullivan, 2000). Tuy nhiên, chúng khá nhuận tràng và gây ñầy hơi khi dùng với liều cao (Losada và Olleros, 2002). 2.1.3. Galactooligosaccharide (GOS): ðược tổng hợp từ ryrup lactose sử dụng enzyme β-galactosidase (Frost và Sullivan, 2000; Gibson, 2004). Chúng không bị thủy phân và hấp thu trong ruột người và chỉ ñóng vai trò là cơ chất cho Bifidobacteria (Frost và Sullivan, 2000). 2.1.4. Ngũ cốc: Ngũ cốc, các loại hạt, ñậu và dầu hạt là nguồn cung cấp xơ ăn kiêng. Acid phytic là ñường bị hexaphosphoryl hóa và chiếm 1 – 5% khối lượng các loại thực phẩm trên. Acid phytic tạo phức với sắt do ñó ngăn chặn những sản phẩm của quá trình oxy hóa như các gốc tự do. ðiều này có thể giải thích cho những ảnh hưởng bảo vệ của xơ ăn kiêng (Taylor và cộng sự, 1999). Ngũ cốc có thể sử dụng như là cơ chất cho quá trình lên men của vi sinh vật probiotic (Charalampopoulos và cộng sự, 2002). Quá trình lên men xơ ăn kiêng bởi vi khuẩn trong ruột kết tạo thàh sản phẩm là các acid béo mạch ngắn (Taylor và cộng sự, 1999; Ridlon và cộng sự, 2006). Butyrate là một acid béo mạch ngắn sản xuất bởi quá trình lên men xơ ăn kiêng. Những cuộc thí nghiệm trên ñộng vật cho thấy butyrate tăng sự sinh sôi và chuyên hóa của tế bào ruột kết. Sự chết theo chương trình (apoptoxis) của những tế bào trong ruột kết cũng bị giảm ñi bởi butyrate (Kailasapathy và Chin, 2000). Quá trình lên men chất xơ tạo thành acid béo mạch ngắn bởi vi khuẩn trong ruột kết làm giảm pH trong ruột. ðiều này làm giảm sự chuyển hóa từ acid mật bậc 1 thành acid mật bậc 2 ñộc hơn (Taylor và cộng sự, 1999). Muối mật bậc 1 kích thích tiêu hóa và tăng hấp thu lipid và những vitamin tan trong dầu tại ruột. Tuy nhiên, khi chuyển thành muối bậc 2, chúng gây ra những bệnh trong ñường tiêu hóa như ung thư ruột kết hay sỏi mật (Ridlon và cộng sự, 2006). Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 5 Ngoài ra, chúng còn ñược sử dụng như là nguồng carbohydrate không tiêu hóa ñược làm tăng một số ảnh hưởng sinh lý có lợi cho cơ thể cũng như kích thích chọn lọc sự phát triển của Lactobacillus và Bifidobacteria có mặt trong ruột kết, do ñó ñóng vai trò như là prebiotic. Chúng chứa các xơ tan trong nước như glucan và arabinoxylan, oligosaccharide như GOS và FOS, tinh bột bền (resistant starch). Tất cả ñều có tính chất của prebiotic. Tinh bột cũng có thể ñược sử dụng ñể làm lớp vỏ bao probiotic ñể làm tăng tính bền trong quá trình bảo quản và làm tăng số lượng sống sót khi di chuyển qua môi trường bất lợi trong ống tiêu hóa (Charalampopoulos và cộng sự, 2002). 2.2. Synbiotic: Synbiotic là sản phẩm chứa một probiotic và một prebiotic (Holzapfel và Schillinger, 2002; Touhy và cộng sự,2003). Chúng ñược ñịnh nghĩa như là một hỗn hợp của một probiotic và một prebiotic ảnh hưởng tốt ñến vật chủ nhờ việc tăng sự sống sót và ñịnh cư của các vi sinh vật sống bổ sung trong ống tiêu hóa, bằng cách kích thích chọn lọc và/hoặc kích hoạt sự trao ñổi chất của một hoặc một số lượng giới hạn vi sinh vật làm tăng sức khỏe cho vật chủ (Kailasapathy và Chin, 2000; Touhy và cộng sự,2003). Do ñó, synbiotic có thể làm tăng sự sống sót của probiotic bằng cách cung cấp cơ chất xác ñịnh cho tế bào probiotic cần thiết cho quá trình lên men (Gallaher và Khil, 1999). Sự bổ sung synbiotic là sự kết hợp Bifidobacteria và FOS, Lactobacillus GG và inulin và Bifidobacteria, Lactobacilli và FOS hay inulin. Sữa lên men chứa vi sinh vật sống có lợi (probiotic) cũng như kích thích hệ vi sinh vật ñường ruột (prebiotic). Do ñó, chúng ñược xem là synbiotic. Nghiên cứu chỉ ra tiềm năng của sữa lên men làm giảm nguy cơ bệnh tật như ung thư ruột kết (Kiebling và cộng sự, 2002; Saikali và cộng sự, 2004). Synbiotic có khả năng kháng vi sinh vật, chống ung thư, ñiều hòa miễn dịch, kháng tiêu chảy, chống dị ứng, giảm lipid trong máu, giảm glucose máu, tăng hấp thu va cân bằng khoáng, chống bệnh giòn xương (antiosteoporotic) (Gallaher và Khil, 1999). 3. KHÓA PHÂN LOẠI PROBIOTIC: 3.1. Vi khuẩn: Các probiotic vi khuẩn là Gam dương thuộc ngành Firmicutes (hệ gen có lượng base nitơ Guanine – Cytosine (G – C) thấp) và Actinobacteria (hệ gen có lượng G-C cao). Bên cạnh ñó cũng có probiotic là Gram âm, ví dụ Escherichia coli thuộc ngành Proteobacteria. Vi khuẩn probiotic bao gồm các giống sau ñây: − Vi khuẩn Acid lactic (Lactic Acid Bacteria – LAB): Nhóm vi khuẩn rất ña dạng này có khả năng lên men cacbohydrate ñể tạo thành acid lactic. ðiển hình của probiotic thuộc nhóm này phải kể ñến Lactobacillus và Bifidobacterium. ðiểm khác biệt giữa Lactobacillus và Bifidobacterium là trong cơ thể Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli 6 người, nếu Lactobacillus chủ yếu ñịnh cư ở ruột non thì Bifidobacterium chủ yếu sinh sống ở ruột già. Bên cạnh ñó còn có Pediococcus, Enterococcus và Lactococcus. − Vi khuẩn không phải vi khuẩn lactic (Non – LAB): nhóm này gồm có: Propionibacterium, Bacillus, Brevibacillus, Sporolactobacillus, Escherichia… 3.2. Nấm men: Nấm men ñược sử dụng như probiotic là Saccharomyces. Theo Kurtzman và Fell (1999), giống Saccharomyces gồm có 14 loài. Còn theo nghiên cứu mới hơn của Kurtzman (2003), giống này chỉ gồm 7 trong số 14 loài ñã công bố trước ñó (gồm: Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces paradoxus, và Saccharomyces pastorianus). Các loài còn lại thì thuộc giống mới có tên là Kazachstania. ðiển hình của nấm men ñược sử dụng như probiotic là Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae sinh sản vô tính bằng cách nẩy chồi, sau ñó chồi sẽ chuyển trực tiếp thành thể nang, bên trong thể nang có chứa các nang bào tử, ñược quan sát khi nuôi cấy chúng trên acetate agar. Một ñiểm dễ dàng nhận thấy ở nấm men này là khả năng lên men ñường rất mạnh ñược ứng dụng rất nhiều trong sản xuất thực phẩm từ sản xuất bánh mì ñến thức uống có cồn từ nguồn nguyên liệu thô ban ñầu rất ña dạng. Ngoài ra, một số nấm mốc (một số chủng Aspergillus), trực khuẩn sinh bào tử khác (Wolfson, 1999; Mombelli và Gismondo, 2000; Fuller, 2003) cũng có tính chất probiotic. Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 7 Phần 2: PROBIOTIC LACTOBACILLI 1. LACTOBACILLI: 1.1. Khóa phân loại: Lactobacillus thuộc ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Lactobacillales, họ Lactobacillaceae. Cùng họ với chúng là Paralactobacillus và Pediococcus (Garrity và cộng sự, 2007). Hình 1: Cây phân nhánh Lactobacilli Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli 8 Lactobacilli là giống (genus) chiếm lượng ñông ñảo nhất trong số các vi khuẩn LAB. Giống này có tính không ñồng nhất (heterogeneous), rất ña dạng về kiểu hình, tính chất hóa sinh và sinh lý. Sự không ñồng nhất này ñược phản ánh bởi hàm lượng các base nitơ G-C trong hệ gen của chúng (tính theo % số mol). Orla-Jensen (1919) ñã phân Lactobacillus thành 3 nhóm phụ là Thermobacterium, Streptobacterium, và Betabacterium. Bảng 1 ñã tổng kết lại các ñặc tính dung ñể phân biệt 3 nhóm này và cũng minh họa một vài loài tiêu biểu của từng nhóm. Sự phân chia dựa trên những ñặc tính sinh lý cơ bản là sự có mặt hay vắng mặt lần lượt enzyme tiết ra cho quá trình lên men ñồng hình và dị hình, fructose-1,6-diphospate aldolase và phosphocetolase. Bảng 1: Sự phân chia nhóm phụ của Lactobacilli Tính chất Nhóm 1, lên men ñồng hình bắt buộc Nhóm 2, lên men dị hình tùy tiện Nhóm 3, lên men dị hình bắt buộc Lên men pentose Tạo CO 2 từ glucose Tạo CO 2 từ gluconate Sự có mặt của FDP aldolase Sự có mặt của phosphocetolase - - - + - L. acidophilus L. delbruckii L. helveticus L. salivarius + - + a + + b L. casei L. curvatus L. plantarum L. sakei - + + a - + L. brevis L. buchneri L. fermentum L. reuteri ( a : khi ñược lên men, b : cảm ứng bởi pentose) Cách cổ ñiển nhất ñể phân biệt các loài Lactobacilli là dựa vào quy luật lên men carbohydrate, cấu hình của acid lactic ñược tạo thành, khả năng thủy phân arginine, ñiều kiện sinh trưởng, nhiệt ñộ sinh trưởng nhất ñịnh. Những tính chất này ñến nay vẫn còn là một công cụ rất hữu dụng nhưng ñể có ñược khóa phân loại thích hợp thì cần phải dựa vào kết quả phân tích peptidoglican, dùng phép thử LDH (Lactate Dehydrogenase Test), % mol G + C của DNA, nghiên cứu về tính tương ñồng DNA- DNA (DNA-DNA Homology). Ngoài ra người ta cũng sử dụng phân tích FAME (Fatty Acid Methyl Ester) ñể nhận diện Lactobacilli từ sữa và các nguồn chứa probiotic. Tuy nhiên phương pháp FAME cũng bộc lộ khuyết ñiểm là khó khăn trong việc ñưa ra các lời giải thích và phải lệ thuộc vào phương pháp xử lý toán học. Một công cụ giúp phân loại ñơn giản hơn ñó là sử dụng ñầu dò oligonucleotide ñặc trưng cho loài (Species- specific oligonucleotide probes) (là một dẫn xuất từ chuỗi rRNA). Các kĩ thuật PCR Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 9 khác nhau và các chuỗi trực tiếp của các phân ñoạn PCR (chẳng hạn, của rRNA) cũng giúp nhanh chóng nhận diện và phân loại Lactobacilli nói riêng và các LAB nói chung. 1.2. ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc tế bào và trao ñổi chất: Lactobacilli phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và ñược sử dụng rất rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm. Lactobacilli gồm có 116 loài (tính ñến tháng 9/2008), là nhóm vi khuẩn Gram dương, kích thước khá nhỏ (<1.5µm), một số khác có thể có chiều dài 5µm, thậm chí 10µm, không có khả năng sinh bào tử, thường không chuyển ñộng, ñôi khi sử dụng ñược nitrate. Hình dạng của các vi khuẩn này thường là hình que hoặc trực cầu khuẩn với hệ gen có hàm lượng G – C thấp hơn 50% (dao ñộng từ 32 – 55%). Chúng ñòi hỏi một môi trường giàu chất dinh dưỡng ñể phát triển và là các vi khuẩn vi hiếu khí. Chúng không có enzyme catalase (Catalase (-)) cho dù hoạt tính pseudocatalase có thể hiện diện trong một vài giống và trong sự có mặt của nhóm heme. Lactobacillus có thể kị khí hay hiếu khí, dung nạp acid (aciduric) hay ưa acid (acidophilic), một số loài có khả năng chịu ñược nồng ñộ muối cao, áp suất thẩm thấu và hoạt tính nước thấp, một số có thể chịu ñược ethanol và chịu ñược muối mật. Chúng lên men ñồng hình (ñồng hình bắt buộc hay ñồng hình tùy tiện) hay dị hình, không có khả năng phân giải protein và lipid ñòi hỏi phải có một phức hợp các chất dinh dưỡng ñể sinh trưởng như carbohydrate, amino acid, peptide, các ester của acid béo, các muối, dẫn xuất của acid nucleic, vitamin… ðối với nguồn carbohydrate, chúng không những sử dụng ñược glucose, fructose, lactose mà còn có khả năng lên men carbohydrate có nguồn gốc thực vật như cellibiose, amygladin, trehalose, thậm chí một số loài có khả năng lên men tinh bột. Khả năng lên men của một số Lactobacilli ñược ñề cập trong bảng dưới ñây: Bảng 2: ðặc tính lên men của Lactobacillus 1 Lên men Giống ñại diện % G + C Sinh trưởng ở 15 o C Cel Fru Gal Lac Mal Sta Suc Thủy phân Arg Nhóm 1: Lên men ñồng hình bắt buộc L. acidophilus L. delbrueckii L. helveticus L. amylophilus L. amylovorus L. cryspatus L. gasseri L. jensenii 34-37 49-51 38-40 44-46 40-41 35-38 33-35 35-37 − − − + − − − − + ± 4 + − + + + + + + ± + + + + + + − + + + + + + + + + − − + ± − + ± ± + + + ± ± ? 3 ? ? + + ? ? ? + ± − − + + + + − ± − ? ? − − + Nhóm 2: Lên men dị hình tùy tiện Quá trình lên men sản xuất Probiotic Lactobacilli 10 L. paracasei L. curvatus L. plantarum L. sakei L. bavaricus L. homobiochii L. coryniformis L. alimentarius 46 43 45 43 43 36 36 36 ? ? + ? ? + + ? + + + + + ± − + + + + + + + + + + + + + + − + + ± ± + + + − ± − + + + + + + + + ? ? ? ? ? ? ? ? + − + + + − + + − − − − − − − − Nhóm 3: Lên men dị hình bắt buộc L. fermantum L. sanfranciscensis L. reuteri L. buchneri L. brevis L. kimchii L. kefiri L. divergens 53 37 41 45 45 35 41 34 + ? ? ? ? + ? + ± − − − − + − + + − + + + + + + + + + ± ± w 5 − ± + − + ± ± − + − + + + + + + + + ? ? ? ? ? V ? ? + − + ± ± + − + + − + + + − + + 1 ðiều chỉnh từ Manual of Systematic Bacteriology – Volume 2, Bergey (1986) 2 Cel – Cellulose; Fru – Fructose; Gal – Galactose; Lac – Lactose; Mal – Maltose; Suc – Sucrose; Star – Starch 3 Không xác ñịnh ñược 4 Phản ứng khác nhau tùy thuộc vào giống hay loài phụ 5 Phản ứng dương tính yếu Nhiệt ñộ tối ưu ñể sinh trưởng khá rộng (30 – 45 o C). 1.3. Phân bố: Các vi khuẩn này hầu như có mặt ở khắp nơi và vì thế có thể tìm thấy chúng ở hầu hết các môi trường, nơi có nguồn cacbohydrate, chẳng hạn như thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt lên men, bột nhào chua (sourdoughs), rau quả, ñồ uống giải khát ), hệ hô hấp, hệ tiêu hóa (GIT) (trong ruột non), cơ quan sinh dục của người và ñộng vật, nước thải và cả ñất trồng. ðối với hệ tiêu hóa và hệ sinh dụng niệu, ñây chính là môi trường ñịnh cư tự nhiên của Lactobacilli mặc dù số lượng của chúng không nhiều bằng Bifidobacterium. Vì thế, không có gì ngạc nhiên khi một lượng lớn các giống trong số chúng ñược ứng dụng như những probiotic trong suốt 70 năm trở lại ñây. 2. HỆ GEN CỦA PROBIOTIC LACTOBACILLI: [...]... Swedish University of Agricultural Science, Sweden University College Cork, Ireland Liu và c ng s (2005) Liu và c ng s (2005) Liu và c ng s (2005) Liu và c ng s (2005) AzcaratePeril và c ng s (2008) Pridmore và c ng s (2004) Kleerebezem và c ng s (2003) Liu và c ng s (2005) Claesson c ng (2006) và s Công ngh ch bi n s a và ñ u ng B ng 4: Nh ng ñ c ñi m di truy n chung c a m t s Lactobacilli thông d ng Gi... chung và m t vài probiotic Lactobacilli nói riêng: Probiotic nh hư ng có l i lên v t ch b ng cách tăng cư ng ho t ñ ng c a các vi sinh v t ñư ng ru t có l i và duy trì s cân b ng vi sinh v t trong ru t (Frost và Sullivan, 2000; Saarela và c ng s , 2000; Matilla-Sandholm và c ng s , 2002; Betoret và c ng s , 2003) Chúng c nh tranh ch t dinh dư ng và v trí bám dính v i nh ng vi khu n gây b nh (Chen và Yao,... tiêu hóa (Goh và Klaenhammer, 2008) Nh ng nghiên c u gen g n ñây v ñáp ng ñ i v i mu i m t c a L acidophilus, L plantarum và L reuteri d a trên môi trư ng in vitro (Bron và c ng s , 2004; Bron và 20 Công ngh ch bi n s a và ñ u ng c ng s , 2006; Pfeiler và c ng s , 2007) ñã m r ng cái nhìn v cơ ch m c ñ phân t c a s dung n p mu i m t các Lactobacilli trong h tiêu hóa Nghiên c u b i Bron và c ng s (2004,... vào t bào bi u mô d dày trư c c a chu t in vivo và ex vivo cũng như thay ñ i ñ c trưng sinh thái trong ru t chu t Có th m t trong nh ng phát hi n thú v nh t là y u t kéo dài Tu (EF-Tu) và GroEL trong kh năng bám dính và kích thích mi n d ch c a L johnsonii (Bergonzelli và c ng s , 2006; Granato và c ng s , 2004) Nh ng nghiên c u này mô t s khu trú trên b m t t bào LAB c a EF-Tu và GroEL C 2 EF-Tu và. .. LcS: Sato và c ng s ñã công b h gen c a LcS Chromosome c a LcS ñư c xây d ng nên b i 3035753 bp nucleotide và ư c tính kho ng 2760 gen, 5 phiên b n rRNA operon, 58 phiên b n tRNA gen và 70 phiên b n c a chu i chèn vào (insertion sequence) Hình 7 phân lo i gen c a LcS LcS có m t vài thi u h t trong gen liên quan ñ n chu trình TCA và t ng h p amino acid Vì th không có vùng tương ñ ng nào gi a LcS và Lactobacillus... tactric, citric ñ t o thành khí CO2, lactic, acetic và các s n ph m ph khác Ph n ng chuy n malic acid thành CO2 và lactic acid là m t ph n ng r t quan tr ng 34 Công ngh ch bi n s a và ñ u ng trong công nghi p s n xu t rư u (con ñư ng lên men malolactic) Các phương th c trao ñ i ch t c a L plantarum ñư c ñánh giá b i Vescovo và c ng s (1993 )và Daeschel và Nes (1995) Vi khu n này cũng có kh năng s n sinh... ru t (Chaillou và c ng s , 2005) ð i v i L bulgaricus, eps 1 và 2 r t g n gi ng nhau (Makarova và c ng s , 2006; van de Guchte và c ng s , 2006) Nhóm gen eps 1 c a ATCC 11842 (Ldb1937 ñ n Ldb1957) và ATCC BAA-365 (LBUL_1800 ñ n LBUL1815) tương t nhau trong khi nhóm 2 thì l i r t ña d ng Makino và c ng s (2006) g n ñây công b r ng nh ng phân ño n polysaccharide ngo i bào có tính acid và phân t lư ng... các exopolysaccharide ñư c t ng h p (Azcarate-Peril và c ng s , 2008) H gen c a L salivarius, L sakei và L bulgaricus ñ u ch a 2 nhóm gen eps khác bi t trong khi L plantarum l i ch a 4 nhóm gen t ng h p polysaccharide b m t khác (Chaillou và c ng s , 2005; Claesson và c ng s , 2006; Kleerebezem và c ng s , 2003; van de Guchte và c ng s , 2006) Sturme và c ng s (2005) m i ñây mô t m t trong nh ng locus... phosphate t pyruvate, oxy và phosphate V i L-lactate oxidase ho c D-lactate dehydrogenase không ph thu c NAD, s n xu t pyruvate và hydroperoxide t lactate và oxy V i NADH oxidase, s n xu t NAD+ và hydroperoxide t NADH, H+ và oxy V i ph n ng kh peroxide không enzyme b i mangan , t o ra hydroperoxide t O2 và hydrogen Lactobacillus plantarum ñòi h i m t nhu c u r t cao v mangan và có th tích lũy m t lư... probi otic Probi otic Probi otic Probi otic Canh trư n g kh i ñ ng, probi otic Probi otic Probi otic Ngu n Alterma nn và c ng s (2005) Makaro va và c ng s (2006) NCBI Azcarate -Peril và c ng s (2008) Pridmor e và c ng s (2004) Kleereb ezem và c ng s (2003) Morita và c ng s (2008) Claesso n và c ng s Quá trình lên men s n xu t Probiotic Lactobacilli subsp salivari us UCC11 8 L ferment AP008 um IFO 937 3956 . PCR Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 9 khác nhau và các chuỗi trực tiếp của các phân ñoạn PCR (chẳng hạn, của rRNA) cũng giúp nhanh chóng nhận diện và phân loại Lactobacilli nói riêng và các. Bifidobacteria (Flamm và cộng sự, 2001). Trong ống Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 3 tiêu hóa (GI tract), bifidogenic oligosaccharide ñược chuyển hóa chỉ bởi vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacteria. Sweden Liu và cộng sự (2005) L. salivarius subsp. salivarius UCC118 1.83 CP000233 University College Cork, Ireland Claesson và cộng sự (2006) Công nghệ chế biến sữa và ñồ uống 13