       - 2013           - 2013 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 LỜI CẢM ƠN Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Võ Thị Thương Lan, người đã chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Cô không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức về chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học. Đó là nền tảng cho quá trình thực hiện luận văn, là hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS. Tạ Bích Thuận. Cô đã luôn động viên, dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong những lúc tôi gặp khó khăn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn NCS. Ngô Thị Hà, NCS. Vương Diệu Linh, ThS. Lê Hồng Thu, CN. Trần Tuấn Anh và các bạn sinh viên Phòng thí nghiệm Sinh Y thuộc Khoa Sinh học, Phòng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống và Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym - Protein đã giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ và anh trai, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ tôi rất nhiều về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 12 năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Thu Hường Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013    ADN Axit deoxyribonucleic ARN Axit ribonucleic bp  cs.  codon Cd Da Dalton dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dUTP Deoxyuridine triphosphate H 2 O  kb Kilobase = 1000 bp M Mol/lit PCR  SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Saline Sodium Citrate TBE - Borate - EDTA Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 DANH MC CÁC BNG Bng Trang Bng 1 m ca mt s loi màng dùng trong k thut lai axit nucleic 19 Bng 2 Thành phn các dung dm và lai c 27 Bng 3 Trình t các mi dùng trong nghiên cc sn phng 28 Bng 4 Trình t u dò oligo dùng trong k thuc 28 Bng 5 Thành phu kin phn ng khun C và T 31 Bng 6 8%  38 Bng 7 Thành phu kin phn ng khui u dò M 39 Bng 8 Thành phu kin tn u dò M vi biotin và DIG 40 Bng 9 Thành phu kin phn i sàng lng tht bin ti Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên gen β-globin 48 Bng 10 Kt qu sàng lt bin ti Cd 17, Cd 26 và Cd 41-42 trên 30 mu bnh phm bng phn i 50 Bng 11 Thành phu kin phn ng PCR vi cp mi CD F/R khun gen β-globin c 700 bp 50 Bng 12 Thành phu kin phn nh du trình t  thuc 53 Bng 13 Tn s t bin gây b-thalassemia  mt s quc gia trên th gii 61 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 DANH MC CÁC HÌNH Hình Trang Hình 1 Mô hình chui xon kép, liên kt hydro và phosphodieste trong phân t ADN 03 Hình 2 S bin tính và hi tính ca phân t ADN si kép 04 Hình 3 Các phân t si kép hình thành trong phn ng lai axit nucleic 05 Hình 4 u dò bch chuyt 07 Hình 5 u dò bi ngu nhiên 08 Hình 6 Nguyên lý chung ca h thu không phóng x gián tip 12 Hình 7 Cu trúc phân t digoxigenin-11-dUTP và biotin-16-dUTP 13 Hình 8 ng cn C, T và M 25 Hình 9 V u dò oligo và cp mi CD F/R trên gen β-globin 30 Hình 10 Kt qu u dò M vi biotin và DIG 41 Hình 11 Kt qu so sánh hiu qu u biotin và DIG và ki nhy ca k thum 42 Hình 12 Kt qu n di kim tra sn phm khun T 43 Hình 13 Kt qu m phân bin T  65 0 C 44 Hình 14 Kt qu m vi các loi ADN khác nhau chn C và n T 45 Hình 15 Kt qu u dò M vn chèn C và T 46 Hình 16 Kt qu m vi plasmid pBluescript và cp mi M13 F/R 47 Hình 17  minh ha v trí các mi s dng trong phn i 49 Hình 18 Kt qu n di sn phi 49 Hình 19 Kt qu tinh sch sn phm PCR mu T9 vi cp mi CD F/R 51 Hình 20 Kt qu so sánh trình t n gen khui bng cp mi CD F/R vi ngân hàng d liu NCBI 52 Hình 21 Kt qu u n gen β-globin vi biotin 54 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 Hình 22 Chuu dò chm lên màng trong k thum c 55 Hình 23 Kt qu c phát hit bin trên gen β-globin ca tng cu dò 55 Hình 24 Kt qu c phát hing tht bin trên gen β-globin 57 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 MC LC M U 1 NG QUAN TÀI LIU 2 1.1. CU TRÚC PHÂN T ADN 2 1.2. NGUYÊN TC CA K THUT LAI AXIT NUCLEIC 3 1.3. U DÒ 5 1.3.1. m cu dò trong k thut lai axit nucleic 5 u dò 6 1.3.3. Các chu dò 9 1.4. MT S K THUT LAI AXIT NUCLEIC 13 1.4.1. Lai ti ch 13 1.4.2. Lai pha lng 15 1.4.3. Lai pha rn 15 1.5. CÁC YU T N K THUT LAI PHA RN 18 1.6. NG DNG CA CÁC K THUT LAI AXIT NUCLEIC 20 U 25 2.1. NGUYÊN LIU, HÓA CHT VÀ THIT B 25 ng nghiên cu 25 2.1.2. Hóa cht 26 2.1.3. Các mi 27 u dò oligo 28 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 2.1.5. Màng lai 29 2.1.6. Thit b 29 2.2. U 29 2.2.1. Thit k u dò 29  30 m 31 2.2.3.1. Bin tính và c nh ADN trên màng nylon (Roche) 31 2.2.3.2. Tin lai và lai 32 2.2.3.3. Phát hiu dò 33 c 34 2.2.4.1. Hot hóa màng nylon (Pall) 34 2.2.4.2. C u dò trên màng nylon (Pall) 34 2.2.4.3. Tin lai và lai 34 2.2.4.4. Phát hiu biotin 35 2.2.5. Tách ADN t mu bnh phm 35 2.2.6. Tách plasmid 36 2.2.7. Tinh sch sn phm PCR bng kit High pure PCR cleanup micro 37 n di 37 T QU VÀ THO LUN 39 A - KT QU 39 M 39 3.1.1. Kt qu khuu dò M 39 Nguyễn Thị Thu Hường K20 - Sinh học Luận văn thạc sĩ khoa học 2011 - 2013 3.1.2. So sánh hiu qu u vi biotin và DIG 41 3.1.3. Chun b trình t  i chng 42 3.1.4. Kt qu m phân bit trình t  i chng 43 C 47 3.2.1. Sàng lc mt s t bin trên gen β-globin 47 3.2.2. Chun b u trình t c 52 3.2.3. Kt qu c phát hit bin trên gen β-globin 54 B - THO LUN 57 T LUN VÀ KIN NGH 62 KT LUN 63 KIN NGH 63 TÀI LIU THAM KHO 63 PH LC 72 [...]... của kỹ thuật lai bao gồm: chuẩn bị và đánh dấu đầu dò, chuẩn bị phân tử đích, biến tính các trình tự ở dạng sợi kép rồi tiến hành lai Nhƣ vậy, một trong các bƣớc đầu tiên và quan trọng nhất, quyết định đến kết quả của phản ứng lai là thiết kế đầu dò Hình 3: Các phân tử sợi kép hình thành trong phản ứng lai axit nucleic [58] 1.3 ĐẦU DÒ 1.3.1 Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic Đầu dò. .. vì các mẫu ADN, kỹ thuật lai điểm đƣợc gọi là lai điểm ngƣợc (reverse dot blot) [11] Nếu nhƣ kỹ thuật lai điểm dùng để xác định một trình tự nhất định trong nhiều mẫu thì kỹ thuật lai điểm ngƣợc đƣợc sử dụng để phát hiện đồng thời nhiều trình tự quan tâm trong một mẫu Đối với lai điểm, trình tự ADN quan tâm đƣợc cố định trên màng, sau đó lai với đầu dò đánh dấu Trong lai điểm ngƣợc, đầu dò không đánh... hóa chất độc hại nhƣ ethidium bromide Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai điểm dot blot" với mục đích: (1) thiết lập đƣợc quy trình lai điểm để phân biệt hai trình tự tƣơng đồng chỉ sai khác nhau tại một số vị trí nucleotide; (2) thiết kế đầu dò và chuẩn hóa đƣợc điều kiện cho kỹ thuật lai điểm ngƣợc phát hiện một số đột biến điểm phổ biến gây bệnh β-thalassemia... nhân dòng có thể sử dụng làm đầu dò trong lai northern blot ARN tách chiết từ nhiều loại mô khác nhau đƣợc chuyển lên màng và lai với đầu dò đặc hiệu Kích thƣớc cũng nhƣ số lƣợng ARN lai với đầu dò đƣợc phát hiện dựa vào vị trí và độ đậm nhạt của băng lai Kết quả thu đƣợc cung cấp dữ liệu về các loại tế bào có gen biểu hiện và sự phong phú của những bản sao phiên mã [55, 58] Kỹ thuật lai điểm dot blot. .. Trƣớc đây, kỹ thuật lai pha lỏng thƣờng sử dụng đầu dò ADN gắn với hạt vi từ, thực hiện phản ứng lai trong dung dịch và tách riêng phân tử lai khỏi dung dịch bằng nam châm Nếu đầu dò đƣợc đánh dấu biotin, phân tử lai đƣợc phân tách nhờ bổ sung hạt từ gắn streptavidin [65] 1.4.3 Lai pha rắn Trong kỹ thuật lai axit nucleic, phân tử đích (ADN hoặc ARN) có thể đƣợc cố định trên pha rắn còn đầu dò tồn tại... Thông thƣờng pha rắn là màng nitrocellulose hoặc màng nylon [55] Một số kỹ thuật lai trên pha rắn thƣờng dùng bao gồm: Southern blot, northern blot, dot blot và reverse dot blot Kỹ thuật lai Southern blot phát minh bởi Edward Southern (1975) nhằm phân biệt một đoạn ADN cụ thể có mặt trong hỗn hợp ADN Trong kỹ thuật này, trình tự ADN đích bị cắt bởi một hay nhiều enzyme giới hạn tạo thành các đoạn đƣợc... 5' lên màng [11, 76] Các kỹ thuật lai trên màng nhƣ Southern blot, northern blot, dot blot hay reverse dot blot đều trải qua các bƣớc tƣơng tự nhau, bao gồm: biến tính các phân tử sợi kép, tiền lai, lai, rửa và phát hiện kết quả lai Nếu trình tự đích và đầu dò ở dạng sợi kép thì chúng phải đƣợc tách mạch tạo dạng sợi đơn Nhiệt độ cao thƣờng đƣợc sử dụng để bẻ gãy các liên kết hydro giữa hai mạch Năng... sẽ đƣợc tiền lai với dung dịch đệm lai không chứa đầu dò Các vị trí trên màng không có ADN sẽ bị bão hòa đối với các loại ADN và phân tử trùng phân có trong đệm tiền lai Đệm tiền lai đƣợc thay thế bằng đệm lai chứa đầu dò và ủ ở nhiệt độ thích hợp để quá trình lai giữa đầu dò đã đánh dấu với phân tử axit nucleic diễn ra Nhiệt độ lai tối ƣu đƣợc xác định bằng thực nghiệm, thƣờng bắt đầu khảo sát ở... những kỹ thuật di truyền phân tử phát triển không ngừng và ngƣợc lại Xu hƣớng trong chẩn đoán phân tử hiện nay nhắm tới những kỹ thuật phát hiện nhanh, đồng thời nhiều trình tự đích với số lƣợng mẫu phân tích lớn nhƣ: PCR đa mồi, lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và giải trình tự gen Đáng chú ý trong số đó phải kể đến kỹ thuật lai điểm (dot blot) - một trong những phát triển của phƣơng pháp lai. .. type virus HPV (Human Papillomavirus) liên quan đến bệnh ung thƣ cổ tử cung Tuy nhiên ứng dụng của kỹ thuật này trong việc xác định những đột biến di truyền vẫn còn rất ít hoặc chƣa đƣợc công bố Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài "Thiết kế đầu dò ADN cho kỹ thuật lai dot blot" với mục tiêu thiết lập quy trình lai nhằm phát hiện những sai khác ở mức độ nucleotide trong các bệnh lý di truyền Đề tài đƣợc thực .  1.3.1. Đặc điểm của đầu dò trong kỹ thuật lai axit nucleic  axit nucleic  (ADN    ARN) [5, 8]. Các ADN    . chu dò 9 1.4. MT S K THUT LAI AXIT NUCLEIC 13 1.4.1. Lai ti ch 13 1.4.2. Lai pha lng 15 1.4.3. Lai pha rn 15 1.5. CÁC YU T N K THUT LAI PHA RN 18 1.6    PCR , lai ADN (Southern blot, dot blot, line blot) và gi  chú ý 