MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA LOÀI ONG 3 1.1.1. Nguồn gốc của ong 3 1.1.2. Hình thái cấu tạo ngoài của ong 3 1.1.3. Vị trí phân loại của ong 4 1.1.4. Các loài ong ở Việt Nam 4 1.1.5. Miễn dịch học ở ong 7 1.2. TÌNH HÌNH THỊ TRƯỜNG MẬT ONG TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƯỚC 8 1.2.1. Tình hình thị trường mật ong trên thế giới 8 1.2.2. Tình hình thị trường mật ong ở Việt Nam 10 1.3. MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP Ở ONG 12 1.3.1. Bệnh ở ong do các tác nhân gây bệnh không phải virus 12 1.3.2. Bệnh ở ong do virus gây ra 16 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN PHÁT HIỆN VIRUS Ở ONG MẬT 23 1.4.1. Phương pháp ELISA (xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) 23 1.4.2. Phương pháp phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) 24 1.4.3. Phương pháp RT – PCR 25 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN ONG VIỆT NAM 25 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1. ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 27 2.2. VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 27 2.2.1. Vật liệu 27 2.2.2. Hóa chất và sinh phẩm 27 2.2.3. Trang thiết bị 28 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1. Phương pháp thu mẫu 30 2.3.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số 30 2.3.3. Xác định nồng độ RNA bằng máy quang phổ nanodrop 31 2.3.4. Tổng hợp cDNA từ RNA tổng số 31 2.3.5. Khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu cho BQCV từ cDNA bằng phản ứng PCR 33 2.3.6. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% 34 2.3.7. Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 35 2.3.8. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli 36 2.3.9. Tách chiết plasmid 37 2.3.10. Cắt kiểm tra plasmid với enzyme giới hạn EcoRI 38 2.3.11. Tinh sạch plasmid tái tổ hợp 39 2.3.12. Giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự tự động ABI 3100 40 2.3.13. Nhân dòng gen mã hóa helicase và xây dựng cây phát sinh loài 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. PHÁT HIỆN SỰ LÂY NHIỄM BQCV TRÊN ONG MẬT Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM 44 3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số 44 3.1.2. Phát hiện BQCV bằng kỹ thuật RT-PCR 44 3.1.3. Tách dòng sản phẩm RT-PCR đoạn DNA đặc hiệu BQCV 46 3.1.4. Kết quả giải trình tự đoạn DNA đặc hiệu BQCV 48 3.2. SỰ PHÂN BỐ CỦA BQCV TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM 51 3.3. XÁC ĐỊNH NGUỒN GỐC CỦA BQCV LƯU HÀNH TRÊN ONG MẬT TẠI CÁC TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên Tiếng Anh đầy đủ Tên Tiếng Việt BLAST Basic Local Alignment Search Tool Công cụ tìm kiếm trình tự cơ bản Bp Base pair Cặp bazơ BQCV Black queen cell virus Virus gây bệnh thối đen mũ chúa cDNA Complementary DNA DNA bổ sung DEPC Diethyl pyrocacbonate DNA Deoxyribonleotide acid DTT Dithiothreito dNTP Deoxyribonleotide triphosphate Et - Br Ethidium bromide IPTG Isopropylthio-β-D-glactoside kDa Kilo Dalton LB Luria Bertani NCBI National Centre for Biotechnology Information Trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học OD Optical Density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Rnase Ribonuclease RT-PCR Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp sao chép ngược DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Ong chúa của đàn ong nội 5 Hình 1.2. Ong chúa của đàn ong ngoại 6 Hình 1.3. Tốp 10 nước đạt kim ngạch xuất khẩu mật ong lớn nhất thế giới năm 2013 9 Hình 1.4. Ấu trùng bị nhiễm BQCV 17 Hình 1.5. Nhộng bị nhiễm BQCV 17 Hình 1.6. Ong chúa khỏe mạnh với mũ chúa mở nắp 17 Hình 1.7. Sơ đồ cấu trúc genom BQCV 18 Hình 2.1. Sơ đồ mô tả các bước thực hiện trong nghiên cứu 29 Hình 2.2. Vector tách dòng pCR2.1 36 Hình 3.1. Kết quả điện di trên gel agarose xác định các mẫu dương tính với 45 BQCV từ các mẫu ong ở miền Bắc Việt Nam. 45 Hình 3.2. Kết quả tách chiết plasmid từ các khuẩn lạc màu trắng và khuẩn lạc màu xanh. 47 Hình 3.3. Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm cắt plasmid 48 tái tổ hợp bằng EcoRI. 48 Hình 3.4. Trình tự đoạn DNA ngoại lai gắn trong vector pCR2.1 tái tổ hợp 49 Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn DNA đặc hiệu BQCV lưu hành ở Việt Nam với trình tự nucleotide của BQCV từ Nam Phi. 51 Hình 3.6. Tỷ lệ nhiễm BQCV giữa các tỉnh miền Bắc Việt Nam 53 Hình 3.7. Cây phát sinh loài BQCV dựa trên trình tự gen mã hóa Helicase 55 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Tình hình nhập khẩu mật ong vào Mỹ năm 2013 11 Bảng 2.1.Thành phần phản ứng của hỗn hợp A 32 Bảng 2.2.Thành phần phản ứng của hỗn hợp B 32 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng tổng hợp cDNA 32 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA đặc hiệu 33 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn nối DNA vào vector tách dòng 36 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid 39 Bảng 2.7.Thành phần phản ứng giải trình tự gen 40 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn DNA mã hóa helicase 42 Bảng 3.1. Kết quả so sánh trình tự nuclotide đoạn DNA tách dòng với các trình tự gen của BQCV trên Genbank 49 1 MỞ ĐẦU Từ xa xưa, ong cũng như các sản phẩm từ ong là những món quà quý giá mà thiên nhiên ban tặng cho con người. Ong có mặt ở khắp mọi nơi trên trái đất đặc biệt là những nơi có thảm thực vật phong phú và đa dạng. Nghề nuôi ong đã và đang một đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người. Ong cung cấp cho chúng ta các sản phẩm có giá trị cao như mật ong, phấn hoa, sữa chúa, keo ong, nọc ong Mật ong, phấn hoa là sản phẩm chính thu từ ong mật, nó không những có tác dụng cung cấp chất dinh dưỡng cho con người mà còn là phương thuốc quý chữa bệnh. Sáp ong, keo ong, nọc ong cũng là sản phẩm có giá trị dùng để chữa bệnh và là nguyên liệu cho một số ngành công nghiệp [6]. Ngoài việc cung cấp các sản phẩm quý kể trên thì con ong còn có vai trò hết sức quan trọng trong nông nghiệp, góp phần làm tăng năng suất cho nhiều loại cây trồng thông qua quá trình thụ phấn cho hoa. Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, khí hậu nóng ẩm mưa nhiều, thảm thực vật phong phú và đa dạng. Đó là điều kiện rất tốt để nước ta phát triển nghề nuôi ong mật, nhưng cũng là điều kiện thuận lợi cho các bệnh ở ong phát triển [1]. Hiện nay, Việt Nam có khoảng 1.500.000 đàn ong với sản lượng trên 37.000 tấn mật ong. Đây là một trong 10 sản phẩm xuất khẩu hàng đầu của cả nước và đang có xu hướng tăng theo từng năm. Tuy nhiên những năm gần đây, ngành ong của nước ta đang phải đối mặt với việc xuất khẩu không ổn định do tình hình dịch bệnh và vấn đề tồn dư kháng sinh có trong mật ong. Ong mật thường bị tấn công bởi nhiều tác nhân gây bệnh bao gồm virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng… Các dữ liệu nghiên cứu về bệnh ong những năm gần đây cho thấy, một trong những nguyên nhân chính gây tổn thất cho nghề nuôi ong của nước ta là do virus, đặc biệt là virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus). Do còn thiếu kiến thức về bệnh ong mật, hoặc không biết chính xác nguyên nhân gây bệnh, người nuôi ong thường sử dụng kháng sinh để kiểm soát tất cả các loại bệnh bao gồm cả virus. Tuy nhiên, bệnh ong do virus không thể được điều trị bằng kháng sinh. Việc sử dụng rộng rãi thuốc kháng sinh như là một điều trị 2 dự phòng cho bệnh không chính xác có thể dẫn đến sự xuất hiện của vi khuẩn kháng kháng sinh, đồng thời dẫn đến tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm của ong. Vì vậy, nghiên cứu phát hiện các virus gây bệnh trên ong mật trong đó có virus gây bệnh thối đen mũ chúa là rất cần thiết và là cơ sở khoa học cho việc phòng chống bệnh, đề ra các biện pháp khoanh vùng dập tắt dịch bệnh góp phần phát triển bền vững ngành nuôi ong. Xuất phát từ các cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Nghiên cứu phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam" với các mục đích nghiên cứu như sau: - Chẩn đoán Black queen cell virus trên ong mật. - Xác định sự phân bố của Black queen cell virus tại các trại nuôi ong mật ở miền Bắc Việt Nam. - Xác định nguồn gốc tiến hóa của Black queen cell virus gây bệnh trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam. Đề tài được thực hiện tại Phòng Vi sinh vật học Phân tử - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA LOÀI ONG 1.1.1. Nguồn gốc của ong Trong lịch sử phát triển của sinh giới thì động vật có hai hướng tiến hoá đó là động vật không xương sống và động vật có xương sống. Trong động vật không có xương sống thì phát triển nhất là ngành chân đốt, trong đó có loài ong. Ong có nguồn gốc từ ngành động vật chân đốt, có tên khoa học là Arthropoda, chân đốt có nguồn gốc từ giun đốt (Annelides) xuất phát từ lớp giun nhiều tơ (Polychaeta). Quá trình chuyển hoá từ giun nhiều tơ sang ngành chân đốt là một quá trình phức tạp hoá về mặt cấu tạo. Tầng Cuticul =>Vỏ kitin (bộ xương ngoài) Biểu bì mô cơ => bó cơ Chi bên => Chi phân đốt Mạch máu lưng => Tim Cơ quan thị giác phát triển phức tạp. Các đốt trước tập hợp thành đầu, đốt giữa thành ngực, đốt phần sau chuyển thành phần bụng. Bên cạnh đó xuất hiện thêm một số cơ quan mới: ống khí, ống Malpighi [3]. 1.1.2. Hình thái cấu tạo ngoài của ong - Cơ thể ong chia làm 3 phần rõ rệt: Đầu, ngực và phần bụng, các phần này được nối với nhau bằng các khớp động. - Có 1 đôi râu. - Có 3 đôi chân và 2 đôi cánh. - Bên ngoài có lớp vỏ kitin gồm nhiều tấm nối với nhau tạo nên bộ xương ngoài. - Trong một tổ ong có 3 cấp: Ong chúa có kích thước lớn nhất, cánh ngắn, bụng dài, có màu nâu đen hoặc vàng; ong thợ có kích thước cơ thể nhỏ nhất, có màu 4 vàng hoặc màu nâu xám hoặc đen xám có sọc vàng, bụng nhọn; ong đực có màu đen, cánh dài, bụng ngắn. 1.1.3. Vị trí phân loại của ong Trong thế giới động vật, ong mật thuộc ngành chân đốt (Arthropoda) hay lớp 6 chân (Hecxapoda), phân ngành có ống khí (Tracheata). Lớp côn trùng (Insecta) Bộ cánh màng (Hymenoptera) Họ ong mật (Aptsdae) Giống ong mật (Apis) Trên thế giới hiện nay có 7 loài ong cho mật, trong đó ở Việt Nam có 4 loài chính: + Ong châu Âu (Ong ngoại): Apis mellifera (A.mellifera) + Ong Nội địa (Ong châu Á): Apis cerana (A.cerana) + Ong Khoái (Ong gác kèo): Apis dorsata (A.dorsata) + Ong Hoa (Ong muỗi): Apis florea (A.florea) Trong mỗi loài lại phân chia thành các phân loài khác nhau như: Đối với ong châu Âu (A.mellifera) có các phân loài: Ong Ý, ong Trung - Nga, ong Cacpat, ong Crain, ong vùng Capcazơ; Đối với ong châu Á A.cerana có: A.cerana cerana, A.cerana indica, A.cerana japonica Mỗi phân loài đó lại có nhiều dạng sinh thái - sinh học hình thành từ lâu đời dưới tác động của các yếu tố ngoại cảnh khác nhau và các đặc điểm thích nghi với điều kiện sống khác nhau. Điều này dẫn đến các đặc điểm có ý nghĩa kinh tế đối với con người cũng khác nhau và có ý nghĩa rất to lớn trong công tác giống ong vì chúng bảo vệ và duy trì được tính đa dạng sinh học thông qua các hệ gen quý hiếm tồn tại trong tự nhiên [3]. 1.1.4. Các loài ong ở Việt Nam Trong 4 loài ong được nuôi ở Việt Nam thì có 2 loài ong có giá trị kinh tế 5 cao, được nuôi rộng rãi để lấy mật và các sản phẩm khác đó là ong nội (ong Châu Á) A.cerana và ong ngoại (ong châu Âu) A.mellifera. Hai loài này có những đặc điểm khác nhau và bổ sung cho nhau. Còn một số loài ong hoang dã như ong khoái (A.dorsata), ong đá (A.laboriosa) hay ong hoa (A.florea) thì vẫn chưa được nghiên cứu, thuần hóa và việc khai thác mật của các loài này chỉ chiếm một tỉ lệ rất nhỏ, chủ yếu mới dừng lại ở mức khai thác và săn bắt trong tự nhiên…  Ong nội (Apis cerana) Hình 1.1. Ong chúa của đàn ong nội Ong nội A.cerana là giống ong bản địa ở Việt Nam, Trung Quốc và một số nước khác. Ở nước ta, ong nội phân bố rộng khắp cả nước ngoại trừ rừng tràm U Minh. Ong nội có kích thước trung bình, đặc tính chăm chỉ, chịu được các điền kiện sống bất lợi, ít dịch bệnh, chất lượng mật tốt, mật ong bán được với giá thành cao. Tuy nhiên, ở ong nội năng suất mật thấp, ong khá hung dữ, dễ bốc bay và dễ chia đàn. Do là loài ong bản xứ nên ong nội thích nghi tốt với nguồn hoa rải rác, điều kiện khí hậu hay thay đổi. Ong nội có thể nuôi từ các quy mô từ hộ gia đình tới nuôi chuyên nghiệp, nhưng nó thích hợp hơn với kiểu nuôi quy mô nhỏ trong gia đình với vốn đầu tư ban đầu thấp và chủ yếu là cung cấp sản phẩm phục vụ tiêu dùng trong nước. Năng suất mật ở ong nội chỉ đạt trung bình khoảng từ 10 - 15 kg/ đàn/năm. Để phát triển ong nội, người nuôi ong cần chọn các đàn có tính tụ đàn [...]... Acute bee paralysis virus (ABPV), Black queen cell virus (BQCV), Chronic bee paralysis virus (CBPV), v Kashmir bee virus (KBV) Trong ú BQCV l mt trong nhng virus c phỏt hin nhiu nht trờn th gii [45] Cỏc virus gõy bnh trờn ong mt l cỏc virus cú b gen l RNA, cú 3 dng kớch thc 17, 30, 35 nm H gen ca nhng virus ny cú th l RNA si ụi hoc RNA si n RNA si n hoc l RNA(+) hoc l RNA(-) Cỏc virus ong mt ó c phõn loi... chớnh l: Iflavirus v Dicistriviridae [16, 26] 1.3.2.1 Black queen cell virus (BQCV) - Phỏt hin v triu chng Virus gõy bnh thi en m chỳa (BQCV) ong mt l mt loi virus ging picornavirus, gn õy nú ó c phõn loi trong chi mi cripavirus (h Dicistroviridae) [35, 38] Virus ny ln u c phõn lp t u trựng ong chỳa cht v t nhng ó b phõn hy mt phn trong cỏc m chỳa mu en, ni chỳng c nuụi dng Khi b nhim virus ny, m chỳa... chn nuụi ong phỏt trin thỡ 95 100% tri ong b nhim chớ nh [11] 1.3.2 Bnh ong do virus gõy ra Cỏc kt qu nghiờn cu gn õy cho thy virus l nguyờn nhõn ch yu lõy nhim v gõy cht ong thm chớ cú th hy dit c n ong [15; 45] t nht cú 18 loi virus khỏc nhau ó c phỏt hin trờn ong [20, 27] Tuy nhiờn, hu ht cỏc bnh ong u do 6 loi virus chớnh sau õy gõy nờn bao gm: Sacbrood virus (SBV), Deformed wing virus (DWV),... lng ln virus c tit ra bi cỏc con ong trng thnh b nhim bnh Trong t nhiờn ong th non dng nh him khi b nhim vi BQCV, bi vỡ u trựng ong th nhn c ớt thc n hn trong mt thi gian ngn hn so vi u trựng ong chỳa (u trựng ong th v ong c ch c nuụi bng sa ong chỳa trong 3 ngy u cũn cỏc ngy sau c nuụi bng hn hp mt v phn hoa) Tuy nhiờn, virus ny c phỏt hin nh l mt bnh nhim trựng khụng biu hin rừ rng nhng ong th t... Tuy nhiờn, lm th no ong mt chng nhim virus qua phn ng t v trung gian t bo vn cha c xỏc nh 1.2 TèNH HèNH TH TRNG MT ONG TRấN TH GII V TRONG NC 1.2.1 Tỡnh hỡnh th trng mt ong trờn th gii Trong nhng nm qua, th trng mt ong th gii cú khỏ nhiu bin ng, giỏ mt ong liờn tc tng cao Theo s liu thng kờ nm 2013 ca Hip hi nuụi ong quc t (APIMONDIA), sn lng mt ong th gii t khong 1,8 triu tn/nm Trong ú, ng u l Trung... phỏt hin lờn n 58% s ong trng thnh trong mựa hố Virus ny tip tc tn ti mt s n ong trong sut nm Tuy nhiờn, t l nhim trựng BQCV nhng thp hn ong trng thnh, vi ti a l 2% trong mựa hố BQCV c phỏt hin nhiu ni trờn th gii ú l nguyờn nhõn ph bin 19 nht gõy t vong u trựng ong chỳa c Ti c, virus ny ó c coi l nguyờn nhõn ph bin nht gõy nờn cỏi cht ca u trựng ong chỳa vỡ nú ó c phỏt hin trong huyt thanh vi t... la chn ging ong tt v cho ch n ung phự hp cng gúp phn ngn chn s lõy lan ca BQCV trong cỏc n ong 20 1.3.2.2 Acute bee paralysis virus (ABPV) õy l loi virus gõy bnh trờn ong c tỡm thy ph bin rng rói hu ht cỏc quc gia trong liờn minh chõu u ABPV nh hng n ong trng thnh khe mnh gõy run v tờ lit trong vũng vi ngy sau khi b nhim bnh ABPV ó c xỏc nh l mt yu t chớnh gúp phn vo t l t vong ca loi ong mt cỏc... polymerase 1.3.2.5 Deformed wing virus Deformed Wing Virus (DWV) l virus cú b gen l RNA, l 1 trong 18 virus ó bit gõy bnh nhiu trờn ong mt, Apis mellifera Virus ny ln u c phõn lp t ong mt cú triu chng Nht Bn vo u nhng nm 1980 v hin nay ang ph bin trờn ton th gii bt c ni no tỡm thy ve Varroa [15] DWV cng ó c phỏt hin bng xột nghim huyt thanh trong ong lựn A florae Fabr v ong mt chõu A cerana Fabr (Allen... nhiu v trớ trờn mRNA.[5] Hin nay, RT PCR l mt trong nhng phng phỏp ph bin nht c s dng phỏt hin virus gõy bnh trờn ong mt 1.5 TèNH HèNH NGHIấN CU CHN ON VIRUS GY BNH TRấN ONG VIT NAM Vit Nam, ngh nuụi ong ó c hỡnh thnh t rt lõu, tuy nhiờn nhng nghiờn cu v virus gõy bnh trờn ong vn cũn rt hn ch, cú rt ớt cụng trỡnh c 25 cụng b Trc õy, vic phỏt hin s cú mt virus thng da vo nhng phng phỏp truyn thng nh... quc gia khỏc Theo Hip hi nuụi ong Vit Nam, Vit Nam tip tc thu c kt qu tt 11 trong vic xut khu mt ong vi th gii trong by thỏng u nm 2014 Tng cng, 27.000 tn mt ong ó c xut khu sang 14 quc gia v vựng lónh th Tuy nhiờn, M vn l th trng ln nht chim 95% tng doanh thu xut khu ca c nc, vi hn 25.000 tn trong 7 thỏng u nm 2014 [49] 1.3 MT S BNH THNG GP ONG Ging nh cỏc ng vt khỏc, ong mt cng d dng mc mt s dch . ngành nuôi ong. Xuất phát từ các cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: " ;Nghiên cứu phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở miền Bắc Việt Nam& quot;. Tình hình thị trường mật ong ở Việt Nam 10 1.3. MỘT SỐ BỆNH THƯỜNG GẶP Ở ONG 12 1.3.1. Bệnh ở ong do các tác nhân gây bệnh không phải virus 12 1.3.2. Bệnh ở ong do virus gây ra 16 1.4. CÁC. trong những nguyên nhân chính gây tổn thất cho nghề nuôi ong của nước ta là do virus, đặc biệt là virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) . Do còn thiếu kiến thức về bệnh ong